JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Abstract

וירוס הפטיטיס C (HCV) משפיע על 3% מאוכלוסיית העולם של וגורם למחלות חמורות בכבד כולל צהבת כרונית, שחמת הכבד, וקרצינומה hepatocellular. HCV הוא נגיף RNA אפף השייכת למשפחה Flaviviridae. טיפול הנוכחי אינו יעיל באופן מלא וגורם לתופעות לוואי שליליות. אין חיסון HCV זמין. לפיכך, מאמץ המשיך נדרש לפיתוח חיסון וטיפול טוב יותר. מערכת תרבית תאי HCV היא קריטית ללימוד שלבים שונים של צמיחת HCV כוללים כניסת ויראלי, שכפול הגנום, אריזה, ויציאה. בהליך הנוכחי שהוצג, השתמשנו וירוס 2a intragenotype פראי מסוג chimeric, FNX-HCV, ווירוס רקומביננטי FNX-Rluc נושא גן כתב לוציפראז Renilla ללמוד את שכפול הנגיף. שורת תאי hepatoma אדם (מבוסס הא-7) שימשה עבור transfection של במבחנה עיבד RNAs גנומית HCV. supernatants תא ללא תרבות, lysates חלבון ולאRNA סך נקצרו בזמן שונים מציין שלאחר transfection להעריך צמיחת HCV. מעמד שכפול הגנום HCV הוערך על ידי RT-PCR ופעמים תקועים RNA לדמיין את הנוכחות של HCV. ביטוי חלבון HCV אומת על ידי מבחני כתם וimmunofluorescence מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבוני HCV NS3 וNS5A. תאי transfected RNA HCV שוחררו חלקיקים זיהומיות לsupernatant התרבות וכייל הנגיף נמדדו. מבחני לוציפראז נוצלו כדי להעריך את רמת השכפול והדבקה של HCV כתב. לסיכום, אנו מציגים מבחני virological שונים לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

Introduction

וירוס הפטיטיס C (HCV) גורם לשחמת כבד וסרטן כבד. זה משפיע 170 מיליון אנשים ברחבי העולם עם 350,000 אנשים מתים מדי שנה 1-3. HCV הוא נגיף RNA גדיל חיובי עם גודל הגנום של 9.6 kb. הגנום HCV מתורגם כמו polyprotein יחיד של ~ 3,000 שאריות חומצת אמינו שהוא ביקע proteolytically ידי פרוטאזות נגיפיות סלולריות שונות ל10 פוליפפטידים. HCV הוא נגיף אב הטיפוס בסוג Hepacivirus ושייך למשפחה של 4 Flaviviridae. עם החשיפה, HCV קובע זיהום כרוני ב80% מהאנשים. הזיהום הוא בעיקר ללא תסמינים בזמן אבחון יכול לאפשר התערבות טיפולית כדי למנוע הידרדרות בכבד. טיפול הנוכחי הוא הכי מוצלח ואין חיסון זמין 5,6.

אטיולוגיה של הפטיטיס C תוארה לראשונה בשינה 1989 7. לימוד שכפול HCV חשוב לחיסון הצהבת מסוג C ומחקר טיפול, אבל זה היההקשו עוד על ידי חוסר של מערכת תרבות ויראלי יעילה. שיבוט מולקולרי של HCV הוצג להיות מידבק שבימפנזים על חיסון intrahepatic 8. בהמשך לכך, replicons HCV תת גנומי תוארו, שאיפשר לנתח את שלב שכפול הגנום הנגיפי ב9,10 מערכת תרבית תאים. גילוי של HCV גנוטיפ 2 א לבודד JFH-1 (הפטיטיס-1 המוחלט של התפקודי היפני), מסוגל להדביק תא תרבות פתח אפיקים חדשים למחקר שכפול HCV 11-13. מתח 2a גנוטיפ JFH-1 וירוסי chimeric בין ותוך genotypic וHCV גנוטיפ 1 מערכות מבוססות תרבות זיהומיות המבוססות זמינות גם כן 14-18.

אנחנו השתמשנו בהצלחה זן JFH-1 ווירוס chimeric 2a intragenotype HCV לך את מפת האפיון פונקציונלי ברזולוציה הגבוהה של תחומים חלבון וcis-מתנהגים אלמנטים RNA 19,20. לפי זה, כאן אנו מתארים מערכת תרבות יעילה בשימוש באופן שיגרתי המאפשרתלומד שלבים שונים של מחזור שכפול HCV והאינטראקציה המאכסן לפתוגן. אנו מציגים מבחני virological להעריך שכפול הגנום נגיפי וinfectivity נובו דה של HCV 2a intragenotype וHCV כתב מבוסס לוציפראז Renilla.

Protocol

מתווה כללית של הפרוטוקול מתואר באיור 1.

1. תאים

  1. הכן תקשורת צמיחה מלאה שמכילה 10-15% בסרום שור העובר (FBS), 10 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 10 HEPES מ"מ, פניצילין (100 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (100 מ"ג / מיליליטר), ו2 מ"מ L-גלוטמין.
  2. לשמור על הא-7.5.1 תאים 13 בתקשורת צמיחה מלאה המכילה תוספים מעל לניתוח במבחנה של מחזור שכפול נגיפי צהבת מסוג C.
  3. זנים נגיפיים תרבות הא-7.5.1 תאים עם צוינה תקשורת צמיחה בתוספת ב-C ° 37 עם 5% CO 2.

2. וירוס והבונה פלסמיד

  1. ליצור את הצורה המשלימה DNA (cDNA) של HCV RNA ולשכפל אותו לוקטור פלסמיד על מנת להקל על מניפולציה גנטית. הערה: גילוי הצהבת המוחלטת של התפקודי היפני 1, JFH-1 (HCV גנוטיפ 2 א), לבודד כבר קריטי למחקר HCV והואבעיקר שימוש ללמוד 11-13 מחזור השכפול של HCV. וירוסי chimeric אינטר וintragenotypic מבוססים על HCV JFH-1 נמצאים בשימוש נפוץ במחקר 14-18. בנייה של וירוס 2a intragenotype הסינתטי chimeric, FNX-HCV, ומתח כתב chimeric monocistronic תוארה בעבר 19 ובניית פרטים הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
  2. השתמש בוירוס 2a intragenotype pFNX-HCV כפי שהוא מכיל 5'NTR, אזורים מבניים וP7, וחלק מהאזורים שאינם מבניים NS2 (נוקלאוטידים 1-2,878) של הזן ההורי J6CF (הצטרפות צמח השדה לא. AF177036), כפי גם הרכיבים שאינם מבניים של זן JFH-1 הנגיפי (הצטרפות צמח השדה לא. AB047639). הערה: FNX-HCV היה מסונתז המבוסס על הרצף של HCV chimeric 2a intragenotype JC1 שדווח בעבר 15.
  3. ליצור מבנה monocistronic chimeric כתב ויראלי, pFNX-Rluc, המבוסס על זן pFNX-HCV (לעיל בשלב 2.2) על ידי החדרת Rגן בלוציפראז enilla בין 5 'NTR וגן הליבה (בין NT 388 ו389). בהמשך לכך, חבר את הגן בלוציפראז וגן ליבה של מבנה זה באמצעות 2A הפה וטלפי וירוס מחלת רצף (F2A) פפטיד, שיפעל כאות מחשוף.
  4. מהנדס הקונסטרוקציה נגיפית פולימראז-null RNA (Pol-) או באמצעות pFNX-HCV או על רקע ויראלי pFNX-Rluc. החלף את שאריות קטליטי פולימראז NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8,623), של אחד מעמודי תווך ויראליים עם שאריות חומצת אמינו AAG.

3. שעתוק במבחנה RNA HCV

  1. השתמש בנגיף HCV-FNX chimeric 2a intragenotype וnull FNX-HCV Pol HCV (Pol-) להערכה של שכפול נגיפי (איור 2 א).
  2. Linearize פלסמידים ויראלי עם אנזים הגבלת XbaI ולאחר מכן לטפל עם nuclease שעועית מונג כדי ליצור קצוות קהים. לטהר את פלסמידים מתעכלים על ידי כרומטוגרפיה אניון-Exchange. לוודא את התקינות of לינארית פלסמיד על ידי חשיפת הדנ"א לagarose ג'ל אלקטרופורזה (איור 2).
  3. לתמלל פלסמידים נגיפיים לינארית באמצעות פולימראז T7-RNA.
  4. לטהר את RNA שטופלה DNase מסונתז החדש באמצעות ערכת טיהור RNA.
  5. ודא ייצור RNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 2 ג).
  6. לכמת את הרנ"א על ​​ידי ספקטרופוטומטר.
  7. אחסן את RNA שנוצר ב-80 מעלות צלזיוס ב10 מיקרוגרם aliquots עובדים. הערה: כדי למזער את הווריאציה של איכות RNA בתוך כל עיצוב ניסיוני על ידי תמלול כל RNA עבור כל דגימה ובקרה נגיפיות באותו הזמן.

4. HCV RNA Transfection ואוסף דוגמאות

  1. לקצור את הא-7.5.1 התאים באמצעות טריפסין.
  2. כדי לשטוף את התאים, צנטריפוגה ו resuspend ההשעיה פעמיים עם תקשורת בסרום נמוכה קרה. Resuspend התאים בתקשורת בסרום נמוך ב1 x 10 7 תאים לכל מיליליטר.
  3. מערבבים בסך הכל 10 & #956; גרם של רנ"א הנגיפי עיבד עם 400 μl של תאי resuspended (4 x 10 6 תאים) בקובט electroporation 0.4-סנטימטר. Transfect התאים באמצעות electroporation ב270 V, 100 Ω, ו950 μF.
  4. Resuspend תאי electroporated ב10 מיליליטר תקשורת צמיחה להשלים עם FBS 15%. הערה: הישרדות מוגברת של תאי electroporated נתפס כאשר הא-7.5.1 התאים בתרבית ב15% שור סרום עוברי.
  5. פלייט התאים בשני T-25 צלוחיות (~ 1.2 x 10 6 תאים לכל בקבוק) וצלחות 48 היטב (1 x 10 4 תאים לכל היטב) לכל אחת מנקודות הזמן הבאות: 4, 48 ו96 שעה.
  6. החלף את המדיה ב4-8 לאחר transfection שעה עם תקשורת צמיחה בתוספת טרי עם 10% FBS כדי להסיר שאריות תאים מתות מהצלוחיות וצלחות תרבית.
  7. supernatants תרבית תאי קציר ב48, 96 נקודות זמן שעה ולהסיר פסולת הסלולר מדגימות שנאספו על ידי צנטריפוגה תאים ב1,500 סל"ד 10 דקות ב 4 º C.
  8. אחסן את supernatants התא ללא ב -80 º C. Lyse התאים לחלבון וניתוח הרנ"א על ​​ידי כתם מערבי ולהפוך PCR שעתוק כמותית בנקודות הזמן שצוינו.

5. הפוך תמלול-PCR (RT-qPCR) להערכת עותקי HCV הגנום

  1. בצע שני שלבים RT-qPCR כדי לקבוע את מספר עותק RNA הגנומי HCV.
  2. לתעתק הפוך 1 מיקרוגרם של רנ"א הסלולרי הכולל באמצעות טרנסקריפטאז הפוך ופריימר ספציפי לגדיל תחושת HCV שנקשר ל5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ") או פריימר ספציפי לisomerase peptidylprolyl גן המשק G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 "). גם להפוך לתמלל FNX-HCV RNA (שנוצר בשלב 3) של עותקים ידועים הגנום (1 אוקטובר - 9 אוקטובר סטנדרטי) באמצעות פריימר גדיל תחושת HCV.
  3. לבצע qPCR באמצעות 50 ננוגרם של cDNA עיבד וכתוצאה מכך שימוש בפריימרים ספציפיים HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ") וה-DNA מחייב צבע ירוק המכיל תערובת סופר qPCR. בצע qPCR לPPIG גן המשק, כמו גם (פריימרים PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 ") הערה: לחישוב רמת RNA HCV תאיים מדויקת על פני דגימות, השתמש גן משק סלולארי, PPIG , רמת ביטוי (מחזור CT) לנורמליזציה. השתמש במספר העותק של הגנום FNX-HCV כתקן לקביעת מספר עותקים.
  4. השתמש בתנאים הבאים בעת הרצת qPCR לקבוע עותק RNA HCV מספר: 95 º C ל15 שניות ו60   º C במשך 30 שניות (40 מחזורים) שימוש במערכת ה-PCR בזמן אמת.
  5. ראה 3A דמויות ו3B לתוצאות שכפול הגנום.

6. מערבי ניתוח סופג לזיהוי ביטוי חלבון HCV (איור 3 ג)

  1. השתמש fr lysates התארנ"א הנגיפי אום transfected ב96 ההודעה hr transfection לניתוח מערבי סופג חלבון.
  2. לפתור את lysate התא באמצעות SDS-PAGE והעברה לdifluoride polyvinylidene קרום (PVDF).
  3. חסום את הממברנה באמצעות פתרון חסימה המכיל חלב דל שומן 5%, 0.2% Tween 20 בופר פוספט (PBS).
  4. דגירה הממברנה עם נוגדן חד שבטי עכבר העיקרי NS3 (1 ב1,000 דילול) ובטא אקטין (1 ב5,000 דילול).
  5. הוספת IgG אנטי עכבר העז מצומדת לחזרה peroxidase (1 ב5,000 דילול) ולזהות על ידי chemiluminescence.

7. Immunofluorescence Assay (IFA)

  1. תקן את התאים וtransfected נגוע HCV באמצעות מתנול למשך 30 דקות במעלות צלזיוס -20 עבור assay immunofluorescence.
  2. שטוף את התא עם PBS שלוש פעמים ולחסום עם IFA חסימת מאגר.
  3. השתמש polyclonal ארנב נגד NS5A נוגדנים בעיקר (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר Dasgupta, UCLA) או עכבר חד שבטי אנטי DSRJ2 NA נוגדנים בדילול של 1:200 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה במשך 5 שעות לשעת 4 בלילה º C.
  4. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר שהנוגדן הראשוני.
  5. הוסף נוגדן עז נגד ארנב IgG-488 polyclonal משנית או עז אנטי עכבר IgG-594 נוגדנים משני polyclonal בדילול 1:1,000 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  6. שטוף תאים עם PBS שלוש פעמים וגרעיני כתם באמצעות צבע Hoechst ולהציג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3D).

8. כייל נגיף מדידה

  1. הא-7.5.1 תאים נאיביים פלייט תאים בכ 3 x 10 3 / גם באמצעות צלחת 96 היטב. למחרת, לבצע דילולים סדרתי של פי 10 של supernatant תרבות תא ללא נקטף מן תאי transfected RNA HCV באמצעות תקשורת צמיחה ולחסן בשלושה עותקים על הא-7.5.1 תאים.
  2. תקן את התאים ב72 לאחר זיהום שעות באמצעות מתנול (ל30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס) וimmunostain לחלבון NS5A HCV כאמור בסעיף 7.
  3. השתמש בדילול הגבוה ביותר לספור למוקדים החיוביים NS5A ולחשב את המספר הממוצע של יחידה ויוצרת מוקד (FFU) למיליליטר. ראה איור 4 לכייל HCV.

9. Renilla בלוציפראז כתב Assay עבור ויראלי הגנום שכפול וInfectivity

  1. להערכת שכפול נגיפי הגנום, הא-7.5.1-תאי electroporated RNA HCV הצלחת בשלושה עותקים בצלחות 48 היטב (1 x 10 4 תאים / טוב).
  2. Lyse התאים עם 75 μl של חיץ תמוגה הפסיבי בשעה 6, 48 שעות, ו96 לאחר transfection שעה.
  3. רוק הצלחות בעדינות ל15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחסן ב -80 º C.
  4. כדי למדוד את הפעילות האנזימטית לוציפראז Renilla, להפשיר lysate החלבון וריאגנטים assay לוציפראז Renilla לטמפרטורת חדר.
  5. הוסף 20 μl של lysate חלבון לכל טוב של 96-wel צלחת הארה לבנה ליטר ולמקם את הצלחת בluminometer.
  6. לוותר של מגיב assay לוציפראז Renilla (מצע coelenterazine + חיץ) לכל טוב ולאחר עיכוב מראש לקרוא 2 שניות 100 μl; לשלב את האור הנפלט ל10 שניות.
  7. לחשב את הממוצע וסטיית התקן עבור כל דגימה מערכי לוציפראז של triplicates הביולוגי ולהכפיף את הנתונים לניתוח סטטיסטי (איור 5).
  8. להערכת infectivity, לחסן 500 μl של supernatant תא ללא המתקבל מתאי transfected RNA HCV לנקודות שצוינו הזמן (48 שעות ו96 hr) בשלושה עותקים על הא-7.5.1 תאים נאיביים בצלחות 48 היטב.
  9. החלף את הבידוד הנגיפי עם 500 μl של מדיום חדש לכל גם אחרי 6 שעות שלאחר זיהום.
  10. Lyse התאים ב48 שעות שלאחר זיהום וכפוף לassay לוציפראז Renilla כמתואר בשלבי 8.2-8.7 (איור 5).
itle "> 10 ניתוח סטטיסטי.

  1. הברים השגיאה בגרפים מצביעים על סטיות תקן (SD). ערכי P חושבו על ידי מבחן t מזווג.

תוצאות

נגיף הפטיטיס C הוא וירוס RNA. כך למטרה מניפולציה גנטית, cDNA גנומי HCV כבר משובט לתוך וקטור פלסמיד חיידקים. רצף אמרגן RNA פולימראז T7 הוצג מייד לפני סוף '5 של הגנום HCV. מתווה כללית של עבודה ניתוח HCV מוצגת באיור 1. כדי לייצר RNA הגנומי HCV עם הסוף מדויק 3 ', הגנום HCV המכיל פל...

Discussion

איור זה מתאר שיטה לניתוח מחזור השכפול של וירוס הצהבת מסוג C. HCV הוא הפתוגן אנושי ופרוטוקול הבטיחות הביולוגי שנקבע יהיה חייב להיות אחריו בקפדנות. מערכות תרבות זיהומיות HCV תא תוארו בעבר 11-13,16,17. יש כמה נקודות קריטיות שאנחנו ליישם כאשר בעקבות הפרוטוקול המאויר. ראשית,...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Non essential amino acidFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1The Scripps Research InstituteThe cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) Cedars-Sinai Medical CenterThe HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaINew England Biolabs Inc.R0145S
Mung Bean NucleaseNew England Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 English & Scientific Consulting Kft.10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF membrane packageBio-Rad162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry MilkBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]Abcamab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]Abcamab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents GE Healthcare Life SciencesRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 real-time PCR systemLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase Assay System kitPromegaE2810
RNase-Free DNasePromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)Promega

References

  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88CHCVCHepatocellular Carcinoma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved