C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

要約

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

要約

C型肝炎ウイルス（HCV）は、世界の人口の3％に影響を及ぼし、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を含む重篤な肝疾患を引き起こす。 HCVは、 フラビウイルス科に属するエンベロープRNAウイルスである。現在の治療は、十分に有効ではなく、有害な副作用を引き起こす。利用可能なHCVワクチンはありません。このように、継続的な努力は、ワクチン、より良い治療法を開発するために必要です。 HCV細胞培養系は、ウイルスの侵入、ゲノム複製、パッケージング、および出口を含むHCV増殖の様々な段階を研究するために重要である。提示現在の手順では、野生型intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびウイルス複製を研究するために、 ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持する組換えFNX-Rlucをウイルスを使用した。ヒト肝癌細胞株（ホ-7ベースの） インビトロでのトランスフェクションのために使用したのHCVゲノムRNAを転写した。無細胞培養上清を、タンパク質溶解物およびtotal RNAは、HCVの増殖を評価するために、トランスフェクション後様々な時点で採取した。 HCVゲノムの複製の状態は、定量的RT-PCRおよびHCVの存在を可視化する二本鎖RNAにより評価した。 HCVタンパク質の発現は、HCV NS3およびNS5Aタンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによって確認した。培養上清およびウイルス力価に感染性HCV粒子を放出するRNAトランスフェクトされた細胞を測定した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはHCVの複製レベルと感染性を評価するために利用した。結論として、我々は、HCVの複製サイクルの異なる段階を特徴付けるための種々のウイルス学的アッセイ法を提示する。

概要

C型肝炎ウイルス（HCV）は、肝硬変および肝臓癌を引き起こす。それは35万人が毎年^1-3死んで全世界1.7億人々に影響を与えます。 HCVは、9.6kbのゲノムサイズを有するプラス鎖RNAウイルスである。 HCVゲノムは、タンパク質分解的に10ポリペプチドに様々な細胞およびウイルスのプロテアーゼによって切断され〜3,000アミノ酸残基の単一ポリタンパク質として翻訳される。 HCVはヘパシウイルス属に原型ウイルスで、 フラビウイルス科 ⁴に属しています。暴露されると、HCVは、個人の80％に慢性感染を確立します。感染は、診断が肝劣化を防止する治療的介入を可能にすることができる主に無症候性かつタイムリーである。現在の治療は、部分最適で、ワクチンは^5,6ありません。

C型肝炎の病因は1989年⁷に記載した。HCVの複製を研究するC型肝炎ワクチンおよび治療 ​​の研究のために重要であるが、それがあった長い効率的なウイルス培養系の欠如によって妨げ。 HCVの分子クローンは、肝内接種⁸時チンパンジーにおける感染であることが示された。続いて、HCVサブゲノムレプリコンは、細胞培養系^9,10におけるウイルスゲノムの複製段階を分析させ、これについて説明した。遺伝子型2aのHCVの発見は、JFH-1（日本劇症肝炎-1）を単離、細胞培養に感染することができる、HCV複製の研究^11月13日のための新たな道を開いた。感染培養系をベース遺伝子型2a株JFH-1ベース間および内遺伝子型キメラウイルス遺伝子型1のHCVにも^14〜18用意されています。

我々が正常タンパク質ドメインおよびシス作用RNAエレメント^19,20の高分解能機能プロファイリングマップを得るために、JFH-1株およびHCV intragenotype 2aのキメラウイルスを使用している。これによれば、ここでは慣用的に使用可能にする効果的な培養システムを記載HCVの複製サイクルと宿主 - 病原体相互作用の様々な段階を研究。私たちは、ウイルスゲノムの複製とintragenotype 2aはHCVおよびウミシイタケルシフェラーゼに基づくレポーターHCVの新規の感染性を評価するために、ウイルス学的ア ​​ッセイを提示する。

プロトコル

プロトコルの概要を図1に示されている。

1。細胞

1. 10〜15％ウシ胎児血清（FBS）、10 mMの非必​​須アミノ酸、10mMのHepes、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を、および2mM L-グルタミンを含有する完全増殖培地を調製する。
2. C型肝炎ウイルスの複製サイクルのインビトロ分析のための上記のサプリメントを含む完全な増殖培地中でホ- 7.5.1細胞の^13を維持する。
3. 5％のCO _2、37℃で指定された補足の増殖培地とホ- 7.5.1細胞で培養したウイルス株。

2ウイルスやプラスミド構築

1. HCV RNAの相補DNA（cDNA）の形態を生成し、遺伝子操作を容易にするためのプラスミドベクターにクローニングする。注：日本の劇症肝炎1の発見は、JFH-1（遺伝子型2aのHCV）、HCVの研究のための批判的とされている単離主にHCVの複製サイクル^{11から13を}研究するために使用。 JFH-1のHCVに基づく間およびintragenotypicキメラウイルスは、一般的に、研究^14〜18で使用されています。合成intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびモノシストロンキメラレポーター株の構築は^、19と建設の詳細は、このプロトコルの範囲を超えて先に説明した。
2. それは（ヌクレオチド1から2878）J6CF親株（NCBIアクセッション番号AF177036）の、よう5'NTR、構造領域とP7とNS2非構造領域の一部が含まれてpFNX抗HCV intragenotype 2aのウイルスを使用して、よくJFH-1ウイルス株（NCBIアクセッション番号AB047639）の非構造部材として。注：FNX-HCVは、以前に報告された¹⁵ Jc1にintragenotype 2aのキメラHCVの配列に基づいて合成した。
3. Rを挿入することで（ステップ2.2以上）pFNX-HCV株に基づいて、モノシストロニックキメラレポーターウイルス構築、pFNX-Rlucをを生成（NT 388と389の間）5 'NTRとコア遺伝子との間enillaルシフェラーゼ遺伝子。続いて、切断シグナルとして働くだろう口蹄疫ウイルス2A（F2A）ペプチド配列を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子およびその構築物のコア遺伝子を接続する。
4. pFNX-HCVまたはpFNX-Rlucをウイルス背景のいずれかを使用して、RNAポリメラーゼ-ヌル（ポル·）ウイルス構築エンジニア。 、AAGのアミノ酸残基とこれらのウイルスの主鎖のいずれかの、NS5Bポリメラーゼ触媒残基、GDD（8615から8623をntのAA 2759年から2761年）を交換します。

3 インビトロのHCV RNA転写

1. intragenotype 2aのキメラウイルスFNX-HCVおよびFNX-HCVルポールヌルウイルス複製（ 図2A）の評価のための（ポル·）は、HCVを使用してください。
2. XbaI制限酵素でウイルスプラスミドを直線化して、平滑末端を生成するために、緑豆ヌクレアーゼで処理する。陰イオン交換クロマトグラフィーによって消化プラスミドを精製する。 oを整合性を検証fは、ゲル電気泳動（ 図2B）をアガロースにDNAを施すことにより、プラスミドを線状化。
3. T7-RNAポリメラーゼを用いて線形化されたウイルスのプラスミドを転写。
4. RNA精製キットを用いて新たに合成されたDNase処理RNAを精製する。
5. アガロースゲル電気泳動（ 図2C）により、RNAの生産を確認してください。
6. 分光測光法によりRNAを定量化する。
7. 10μgの作業アリコートで-80℃で生成したRNAを保管してください。注：同じ時に各ウイルスのサンプルおよびコントロールのためのすべてのRNAを転写することにより、各実験計画の中にRNAの品質のばらつきを最小限に抑えます。

4。のHCV RNAのトランスフェクションおよび検体採取

1. トリプシンを用いたHuh-7.5.1細胞を採取する。
2. 細胞、遠心分離機をすすぎ、冷たい低血清培地で二回、サスペンションを再懸濁し。 ml当たり1×10 ⁷個の細胞で低血清培地で細胞を再懸濁します。
3. 10＆＃合計を混ぜる956; 0.4 cmのエレクトロポレーションキュベット中に再懸濁細胞（4×10 ⁶細胞）を400μlの転写されたウイルスRNAのG。 、270 Vでエレクトロポレーションを介して細胞をトランスフェクト100Ω、および950μF。
4. 15％FBSと10ミリリットル完全増殖培地中でエレクトロポレーションした細胞を再懸濁。注：許-7.5.1細胞は15％ウシ胎児血清中で培養したときにエレクトロポレーションした細胞生存性の増大が見られる。
5. 4、48及び96時間：両方のT-25フラスコ（フラスコあたり〜1.2×10 ⁶細胞）を、48ウェルプレートに以下の時点の各々について（ウェル当たり1×10 ⁴細胞）で細胞をプレート。
6. 培養されたフラスコおよびプレートから死細胞破片を除去し、10％FBSを新鮮な増補増殖培地で4-8時間のトランスフェクション後にメディアを交換してください。
7. 収穫細胞培養上清48、96時間の時点で、4℃で10分間、1500rpmで細胞を遠心分離によって収集したサンプルから細胞破片を除去 ºCの
8. -80ºCで無細胞上清を保存する溶解ウエスタンブロットによるタンパク質およびRNA分析のために、示された時点で転写定量的PCRリバース細胞。

5。HCVゲノムコピーを評価するための転写定量PCR（RT-qPCRの）をリバース

1. HCVゲノムRNAコピー数を決定するために、ツーステップRT-定量PCRを行う。
2. またはハウスキーピング遺伝子のペプチジルイソメラーゼG（PPIG R特異的なプライマー：逆、逆転写酵素と5'NTR（5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 'JFH RTQ R）に結合し、HCVのセンス鎖特異的なプライマーを用いて、全細胞RNAの1μgのを転写：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '）。また、HCVのセンス鎖プライマーを用いて、既知のゲノムコピー^（1月 10 ^日から^9月 10 ^日までの標準）の（ステップ3で生成された）FNX-HCV RNAを逆転写。
3. （HCV JFH RT特異プライマーを用いて得られた転写されたcDNA 50ngのを用いて定量PCRを行うことQF：5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 '）およびDNAの定量PCRスーパーミックスを含むグリーン色素を結合。だけでなく、ハウスキーピング遺伝子PPIGための定量PCRを行う（プライマーPPIG F：5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3'）注：サンプル間で正確な細胞内のHCV RNA量を計算するため、細胞のハウスキーピング遺伝子、PPIGを使用正規化のため、発現量（Ctの周期）。コピー数の決定のための標準としてFNX-HCVゲノムのコピー数を使用してください。
4. 15秒95ºCと60：のHCV RNAコピー数を決定するために、定量PCRを実行するときに、以下の条件を使用してください リアルタイムPCRシステムを用いて30秒（40サイクル）ºC。
5. ゲノム複製の結果を得るために、図3Aと図3Bを参照してください。

6。ウェスタンブロッティング分析HCVタンパク質の発現（図3C）を検出する

1. 細胞溶解物のFRを使用して、OMウイルスRNAは、タンパク質ウェスタンブロッティング解析のための96時間後、トランスフェクションでトランスフェクトした。
2. SDS-PAGE及びポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写を用いて細胞溶解物を解決する。
3. 5％スキムミルク、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.2％Tween 20を含むブロッキング溶液を用いて膜をブロックする。
4. 一次マウスモノクローナル抗体のNS3（1千倍希釈）およびβ-アクチン（1 5000倍希釈）を有する膜をインキュベートする。
5. 西洋ワサビペルオキシダーゼ（1 5000倍希釈）に結合したヤギ抗マウスIgGを加え、化学発光によって検出します。

7。免疫蛍光アッセイ（IFA）

1. 免疫蛍光アッセイのため-20℃で30分間メタノールを使用してHCV感染およびトランスフェクトされた細胞を固定します。
2. PBSで三回細胞を洗浄し、IFAはブロッキング緩衝液でブロックする。
3. ウサギポリクローナル抗NS5Aは、主に抗体（親切に博士ダスグプタ、UCLAによって提供される）またはマウスモノクローナル抗DSR使用NA抗体1:200（1μg/ ml）を希釈でJ2と5時間に一晩4でインキュベート ºCの
4. 3回の一次抗体の後、PBSで細胞を洗浄。
5. ヤギ抗ウサギIgG-488ポリクローナル二次抗体または1:1,000希釈（1μg/ ml）を少なくともヤギ抗マウスIgG-594ポリクローナル二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートする。
6. 蛍光顕微鏡（ 図3D）を使用して、ヘキスト染料とビューを用いてPBS 3回染色核で細胞を洗浄。

8。測定ウイルス力価

1. プレートナイーブホ-7.5.1細胞を、約3×10 ³細胞/ウェルで96ウェルプレートを用いて。翌日、増殖培地を用いて、HCVのRNAトランスフェクトした細胞から採取し、無細胞培養上清の10倍段階希釈を実施したHuh-7.5.1細胞の上に三重で接種する。
2. -20℃で30分間、メタノールを（使用して72時間の感染後、細胞を固定。
3. NS5A陽性病巣のためにカウントしミリリットル当たり焦点形成単位の平均数（FFU）を計算するために最高希釈を使用しています。 HCV力価については、図4を参照してください。

ウイルスゲノム複製および感染のため9。 ウミルシフェラーゼレポーターアッセイ

1. ウイルスゲノムの複製、48ウェルプレート中で三連でプレートHCVのRNA電気穿孔たHuh-7.5.1細胞（1×10 ⁴細胞/ウェル）を評価する。
2. 溶解6時間での受動溶解緩衝液75μlを、48時間、および96時間後にトランスフェクションした細胞。
3. -80ºCで室温店で15分間穏やかプレートを揺する
4. ウミシイタケルシフェラーゼ酵素活性を測定するために、室温にタンパク質溶解物およびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ試薬を解凍する。
5. 96-WELウェル当たりタンパク質溶解液20μlを追加 Lホワイト発光プレートルミノメーターでプレートを置き。
6. ウェルあたり2秒先読み遅延の後にウミルシフェラーゼアッセイ試薬（セレンテラジン基質+バッファ）の100μLを分注する。 10秒間照射された光を統合する。
7. 生物学的な三連のルシフェラーゼ値から、各試料の平均値と標準偏差を計算し、統計的分析（ 図5）にデータを供する。
8. 感染性を評価するため、48ウェルプレートにナイーブホ - 7.5.1細胞の上に三重に指示された時点（48時間および96時間）のためのHCV RNAトランスフェクトした細胞から得られた無細胞上清500μlを接種。
9. 6時間後に感染した後、ウェルあたりの新鮮な培地500μlのウイルス接種を交換してください。
10. 溶解ウミシイタケルシフェラーゼアッセイと48時間後に感染し、対象の細胞のステップ8.2から8.7（ 図5）で説明したように。

イトルを記入 "> 10。統計解析

1. グラフ中のエラーバーは標準偏差（SD）を示す。 P値は、対応のないt検定により計算した。

結果

C型肝炎ウイルスはRNAウイルスである。このように遺伝子操作の目的のために、HCVゲノムcDNAを、細菌プラスミドベクターにクローニングされている。 T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列は、HCVゲノムの5 '末端の直前に導入した。 HCV分析ワークフローの概要を図1に示す。正確な3 '末端とHCVゲノムRNAを生成するために、プラスミドを含むHCVゲノムは、XbaI制限酵素で切?...

ディスカッション

この図は、C型肝炎ウイルス複製サイクルを分析するための方法を記載している。 HCVはヒトの病原体であり、所定の生物学的安全性プロトコルは、必ず守っていただきます。感染性HCV細胞培養系は、以前に^11-13,16,17記載されている。示されたプロトコルを以下のときに我々が実装し、いくつかの重要なポイントがあります。まず、下流の研究のために無傷の完全長ウイルスゲノムRNAの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega