反向遗传吗啉使用方法心脏心室射出转染多难靶组织中的斑马鱼幼虫

摘要

一个适应性强的反向遗传学方法，斑马鱼在后来的发展和生理平衡，如使用基因特异性吗啉脑室注射组织再生的阶段来评估基因的功能。

摘要

斑马鱼是了解细胞和器官和附肢再生的分子生物学研究的重要模式。然而，分子的策略采用反向遗传学还没有得到充分的研究，以评估在斑马鱼胚胎发生后幼虫阶段再生或组织稳态的基因功能，而斑马鱼幼体中的多个组织是困难的目标。的基因特异性吗啉脑室注射对当前不能在这些阶段中，以基因组靶基因斑马鱼在时间上控制的方式提供另一种方法。此方法允许完全分散和吗啉代的后续掺入到整个身体的各种组织，包括在以前是不可能达到如那些在幼虫尾鳍，经常用于非侵入性地研究的组织再生的结构的结构。在幼虫finfold再生激活一些基因也PRESEN吨再生成年脊椎动物组织中，所以幼虫是一个有用的模型，以了解再生的成年人。这啉分散法允许快速和容易识别所需的幼虫组织的再生，以及其他生理现象后，胚胎发育调控组织稳态的基因。因此，该发送方法提供了一种目前所需要的策略临时控制到胚胎后，基因功能的评价。

引言

器官和附肢再生的生存和健康极其重要;然而，一些脊椎动物包括人类有限的再生能力。虽然一些动物模型中存在有大量的再生能力，反向遗传技术的器官和附肢再生过程中，评估基因的功能仍十分有限或不存在。因此，需要采取新方式来剖析再生的分子生物学在这些模式生物。

斑马鱼是一种行之有效的模式对于了解细胞和器官和附肢再生的，不仅是因为再生多个器官，组织和附属物其显著的能力，而且也为^1，分子生物学，因为几个转基因鱼系的存在是为了追踪细胞和以过表达基因构建体^2，3。然而，在斑马鱼幼鱼基因抑制主要限于overexpre裂变的显性负性结构，这并不适用于所有感兴趣的基因或转基因，其产物可以获取功能获得的效果是不反映基因的内源活性。因此，另一种方法，通过基因敲除或敲除专门去除基因的表达是需要克服这些问题。

基因特异性使用TALENS存在作为反向遗传学手段敲除基因的功能定位;然而，这淘汰赛策略是非常频繁局限于功能评估在早期胚胎发育，因为基因的初步要求预防胚胎发育的进一步发展。因此，学习后的现象，如使用TALENS发展后再生或器官的动态平衡被排除^4，5。因此，另一种基因去除的策略是必要的，早期的发展目标后，基因的功能，以评估完全形成器官和结构基因的要求。

吗啉注射已被证明是有效的靶向基因在几个成年器官和成年再生鳍^6-8，但是这些方法都需要电穿孔和许多内部器官都难以电穿孔或者由于它们的位置或由于其电气灵敏度中断。此外，在一些幼虫组织是难以直接注入，由于直接喷射可能会破坏其结构的完整性，或者因为它们的大小被限制。幼虫的尾鳍就是这样的一个结构，因为直接注射到finfold是不可能的。因此，另一种电穿孔和直接注射是需要的靶基因在组织中，要么太小注入或不能被电穿孔。

为了幼虫尾鳍的再生过程中对目标和抑制特定基因的功能，我们已经修改现有啉技术允许一个基因功能的过程中下旬上演幼虫尾鳍再生ssessment。这种方法采用荧光素标记的吗啉脑室交付⁹用Endo-Porter的转染试剂¹⁰在一起。一旦进入心室，吗啉代的Endo-波特混合物迅速传遍整个幼虫通过脉管系统，并进入到先前已不可能对靶组织。这种注射方法可以被修改以靶基因在特定组织和很可能可以在目前缺乏的反向遗传学方法来抑制基因的功能的其他动物模型中被应用。因此，它提供了一个快速简便的方法与范围广泛的使用过程中在幼虫期一般器官平衡和再生，立即研究基因功能的潜力。

研究方案

1（图1）的玻璃针的下游

1. 用玻璃毛细管，直径0.75毫米以制备注射针头（ 图1A）。
2. 将玻璃毛细管进针车夫和拉针使用以下参数：加热循环值：463;拉动周期值：230;速度：150毫秒;时间：150毫秒（ 图1B）。
3. 打破与制表师用镊子拉玻璃毛细管，产生下用测微目镜一个立体镜20微米直径的针。
4. 使用车床用湿润的橡胶纺车，是加强针，并产生一个20微米的伞（ 图1C和1D）。注意：夏普，斜面针改善易于插入到心室，从而最大限度地减少对组织的损害，并允许在穿孔的肌肉切除针（ 图1E-G）之后重新密封。

2。Prepar吗啉溶液的振动性

1. 通过溶解在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的冻干的吗啉代，以7.5毫米的最终浓度制备的吗啉代库存。 [参见制造商的说明资料（材料表）]。
2. 通过混合2.5微升啉原液（7.5毫摩尔）与2.8微升的Endo-Porter的储备溶液（1毫摩尔）（见材料表）为3.5毫啉和0.5mM的Endo-Porter的终浓度制备的吗啉注射溶液。

3，吗啉注射液的制备（图2）

1. 加载斜角玻璃针与5微升该溶液的使用微量用10微升微加载枪头。
2. 插入玻璃针插入连接于气动微微泵（ 图2A-C）的微操作的持针器。
3. 将针保持器旁边的显微镜，使针只需要在一个平面方向上移动，以将其插入幼虫（ 图2A）的心室。
4. 调整角度为注射剂在45°左右。
5. 将微量值如下：保压压力：20磅每平方英寸（psi）;喷射压力：15磅;门的100毫秒范围，1.9周期值（对应于10.9毫秒）。
6. 使用标准的微波，产生20ml的1.5％（重量/体积）的凝胶在1×PBS中熔化琼脂糖。倒入熔化的凝胶放入一个10cm培养皿。放置槽注入的形式进入温暖的琼脂糖这样一旦硬化，琼脂糖将有沟，其中镇静幼虫将放在^11（ 图2D和2E）。

4，注射剂（图3）

1. 麻醉幼虫在100毫升水族箱的水与20 mg / L的三卡因（1 - 乙基-M-氨基苯甲酸酯甲磺酸酯），直到他们停止响应触摸。
2. 用塑料巴斯德pipett以e为镇静幼虫小心转移到湿琼脂糖模具的凹槽，以使腹侧面朝靠在凹槽（ 图3A）的垂直琼脂糖壁。
3. 将琼脂糖板的立体显微镜下，使心室背向注射针（ 图3A）。
4. 降低针以将其插入到心脏心室。将针头只有1-2微米入脑室，注意不要插入针太深（ 图3B和3C）。
5. 一旦将针插入时，吗啉溶液与4-6个脉冲，每个提供3 NL溶液注入脑室，与等待时间间隔，以允许心脏（ 图3D和3E）的清除。
6. 注射后，取出针（平行插入的平面），然后小心地用塑料巴斯德吸管充满E3媒体BAC转幼虫K表到含有新鲜的E3媒体的培养皿。
7. 将针头插入含有1x PBS的培养皿中，以防止针的干燥输送所注入的幼虫时。
8. 重复步骤4.1-4.6每12-24小时进行的实验的持续时间。注意：重​​复注射，确保在细胞中的吗啉代基的吸收和维修。

5，注射的分析（图4）

1. 在100毫升的水族箱的水与20 mg / L的三卡因麻醉的鱼，直到他们停止响应触摸。
2. 将幼虫横向放置在平坦的湿的1.5％（重量/体积）的琼脂糖板覆盖E3介质。
3. 使用带有明和荧光成像立体显微镜图像幼虫。注：由于幼虫是透明的，荧光素标记的吗啉代应该是荧光绿色的血管遍布直接注射后动物可见。此荧光将进一步分散到血管组织中15分钟（ 图4A-4C）。

再生向外长出6。评估

1. 使用斐济图片Ĵ免费软件（http://fiji.sc/Fiji）评估拍摄的图像。为了研究再生，使用线追踪工具来确定再生的增长发生在控制和吗啉注射幼虫的数量。
2. 要校正的图像，打开通过拖放文件到主窗口斐济在斐济的原始图像文件之一。
3. 要设置刻度以下所有图片，请在主菜单中的“分析”。
4. 在下拉菜单中点击“设置比例”。
5. 在这个窗口中，打开通过单击复选框“环球”选项。
6. 现在打开通过拖放（参见步骤6.1）再次测量再生生长量的图像。
7. 请在工具栏上的“写意选择”工具。
8. 包围要测量的区域（ 连接gures 4J-4L）。
9. 按Ctrl + M。这将打开一个新的“结果”窗口显示在正方形像素的包围区域的价值。

结果

锋利，斜面注射针很容易放置在斑马鱼幼虫的心室背侧接触（ 图3A）时 ​​。的心脏继续泵送和血流维持尽管针（ 图3B和3C）的存在。小心打针不扰乱心室或心脏收缩（ 图3D），尽管注射吗啉代入心脏（ 图3E）的形态。

在几分钟内，吗啉代的Endo-波特溶液通过脉管系统（ 图4A和4B）分布?...

讨论

脑室注射提供了一个快速和可靠的评估方法，用于测试基因的功能在以后的身体内环境稳定的发展阶段，或在不影响胚胎发育过程中的基因功能。为了确保这项技术的成功，人们应该知道的四个关键点：1）针头大小，2）晒出针，3）尽量减少体积，并在镇静解4）最小的曝光时间。针太小会经常堵塞，而针是太大，会损伤脑室，引起出血过多。而20微米的建议，针不应该超过五分之一的心室腔的大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections