JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Özet

Zebra balığı hücre ve organ ve apendiks yenilenme moleküler biyolojisini anlamak için önemli bir modeldir. Ancak, ters genetik istihdam moleküler stratejiler henüz yeterince Zebrafish embriyogenezin sonra larva dönemlerinde rejenerasyon veya doku homeostazisindeki gen fonksiyonunu değerlendirmek için geliştirilmiş değil, ve Zebra balığı larva içinde çeşitli dokuları hedeflemek için zordur. Gene özgü morpholinos intraventriküler enjeksiyonlar genomik bu aşamalarda, bir zamansal olarak kontrollü bir şekilde zebra balığı genlerin hedef mevcut yetersizlik için alternatif bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önce bu tür larva kuyruk kanadı, genellikle, invaziv olmayan doku yenilenmesini aratmak için kullanılan bir yapı gibi ulaşmak mümkün olmayan yapılar dahil olmak üzere, vücutta çeşitli dokular içine tam dağılım ve morfolino sonraki dahil edilmesine imkan verir. Larva finfold rejenerasyon sırasında aktive edilen çeşitli genler de Presen ediliryetişkin omurgalı doku yenileyici t, yani larva erişkinlerde rejenerasyon anlamak için bir modeldir. Bu yöntem, morfolino dağılım larva doku tamiri gibi embriyojenez sonra doku homeostazını düzenleyen diğer fizyolojik olayları için gerekli genlerin hızlı ve kolay tanımlanması için gereklidir. Bu nedenle, bu dağıtım yöntemi embriyojenez sonra gen fonksiyonunun değerlendirilmesi için zamansal kontrol için şu anda ihtiyaç strateji sağlar.

Giriş

Organ ve ekleri rejenerasyon yaşam ve spor için temelde önemli olan; Ancak, insan dahil birçok omurgalı rejeneratif yetenekleri sınırlıdır. Çeşitli hayvan modellerde kapsamlı rejeneratif kapasiteye sahip olduğunu mevcut olmakla birlikte, organ ve apendiks rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu değerlendirmek için genetik teknikler ters çok sınırlı ya da varolmayan kalır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar bu model organizmaların yenilenme moleküler biyoloji incelemek gerekmektedir.

Zebra balığı birkaç transgenik balık hatları hücreleri izlemek için var, çünkü hücre ve nedeniyle önemli çoklu organ, doku ve uzantıları yeniden yeteneği, ama aynı zamanda değil tek organ ve apendiksinde rejenerasyon 1, moleküler biyoloji anlamak için iyi kurulmuş bir modeldir ve genini aşırı ifade eden 2, 3, oluşturur. Bununla birlikte, larva Zebrafish gen inhibisyonu esas olarak overexpre sınırlıdırolan transgen ürünü genin endojen aktivitesi yansıtmamaktadır kazanç fonksiyon-etkilerini elde etmek için her ilgi genleri ya da mevcut değildir dominant-negatif yapılar, salgılanması. Bu nedenle, özel olarak nakavt veya demonte gen ifadesini ortadan kaldırmak için alternatif bir yöntem, bu sorunların üstesinden gelmek için gereklidir.

TALENS gen fonksiyonu nakavt için ters genetik aracı olarak kullanan mevcut gen hedefleme özgü; genin ilk gereksinimleri embriyonik gelişimin ilerleyişi önlemek çünkü ancak, bu nakavt strateji, çok sık erken embriyonik dönemde fonksiyonel değerlendirmelere sınırlıdır. Dolayısıyla, bu tür Talens kullanarak geliştirme sonra rejenerasyon veya organ homeostasisin sonraları olayları inceleyerek, 5 4 engellenir. Bu nedenle, alternatif bir gen çıkarma stratejisi tamamen oluşmuş organ ve yapıların gen gereksinimlerini değerlendirmek için erken gelişme sonrası gen işlevini hedefleyen ihtiyaç duyulmaktadır.

Morfolino enjeksiyon birkaç yetişkin organlarında genleri hedef ve yetişkin fin 6-8 rejenere etkili olduğu gösterilmiştir, ancak bu yöntemler elektroporasyon gerektiren ve çok iç organları nedeniyle konuma veya dolayı elektrik duyarlılıklarına ya electroporate zordur bozulması. Doğrudan enjeksiyon yapısal bütünlüğünü bozabilir, çünkü ya da boyut sınırlayıcı olduğu için Dahası, larva bazı dokular doğrudan enjekte etmek zordur. Finfold içine direkt enjeksiyon mümkün değil çünkü larva kuyruk yüzgeci, böyle bir yapıdır. Bu nedenle, elektroporasyon ve direkt enjeksiyon için alternatif ya da enjekte etmek için çok küçük ya da elektroporasyona edilemez dokularda genlerin hedeflenmesi için gerekli idi.

Larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında belirli genlerin işlevini inhibe etmek ve hedef amacıyla, mevcut morfolino sağlayan teknolojiler değiştirilmiş olan birGeç-aşamalı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında gen fonksiyonu ssessment. Bu yöntem, bir arada Endo-Porter transfeksiyon reaktifi 10, fluorescein-etiketli morpholinos intraventriküler teslim 9 kullanmaktadır. Bir kez ventriküle, morfolino-Endo-Porter karışımı hızla damar yoluyla larva yayılır ve hedef önceden imkansız olmuştur dokuları girer. Bu enjeksiyon yöntemi özel dokularda genlerin hedeflenmesi için modifiye edilebilir ve büyük ihtimalle halen gen fonksiyonu inhibe etmek için ters genetik yöntemler eksikliği diğer hayvan modelleri olarak uygulanabilir. Böylece, hemen larva aşamasında genel organı homeostasis ve rejenerasyon sırasında gen işlevini incelemek için geniş bir yelpazede kullanım potansiyeli ile hızlı ve kolay bir yöntem sunar.

Protokol

1.. Cam İğneler hazırlanması (Şekil 1)

  1. Enjeksiyon iğneleri (Şekil 1A) hazırlamak için bir 0.75 mm çapa sahip bir cam kılcal kullanın.
  2. Bir iğne çektirmenin içine cam kılcal yerleştirin ve aşağıdaki parametre ile iğneyi çekin: ısıtma çevrimi değeri: 463; döngüsü değerini çekerek: 230; hız: 150 ms; süresi: 150 msn (Şekil 1B).
  3. Bir mikrometre mercek ile Stereoskop altında 20 mikron çaplı bir iğne üretmek için saatçi cımbızla çekti cam kılcal kırın.
  4. Iğne keskinleştirmek ve 20 mikron eğimi (Şekil 1C ve 1D) üretmek için, ıslatılmış kauçuk çıkrık ile bir torna kullanın. Not: Sharp, eğimli iğneler ventrikül içine yerleştirilmesi kolaylaştıracak ve böylece doku hasarı en aza indirmek ve kas delikli iğnenin (Şekiller 1 E-G) çıkarılmasından sonra yeniden mühürlemek için izin verir.

2. PreparMorfolino Çözüm ation

  1. 7.5 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 'de liyofilize morfolino çözülmesiyle morfolino stoku hazırlayın. [Detaylar için üreticinin talimatlarına (Malzemeler tablo) bakın].
  2. 3.5 mM ve 0.5 mM morfolino Endo-Porter nihai konsantrasyonu için 2.8 ul Endo-Porter stok çözeltisi (1 mM) (Malzemeler tabloya bakınız) 2.5 ul morfolino stok çözeltisi (7.5 mM) karıştırılarak morfolino enjeksiyon çözeltisi hazırlayın.

3.. Morfolino enjeksiyon preparasyonu (Şekil 2)

  1. 10 ul Microloader pipet ucu ile bir mikropipet kullanılarak, bu çözeltinin 5 ul kesik cam iğne yerleştirin.
  2. Pnömatik pico pompanın (Şekil 2A-C) bağlı mikromanipülatör iğne tutucuya cam iğne takın.
  3. Sonraki mikroskop iğne tutucu yerleştirin iğne sadece ihtiyaçları böylecelarva (Şekil 2A), kardiyak ventrikül içine eklemek için bir düzlemsel yönde taşınacak.
  4. Yaklaşık 45 ° enjeksiyonlar için açısını ayarlayın.
  5. Tutma basıncı aşağıdaki gibidir: mikroenjektör değerlerini ayarlayın inç kare (psi) başına 20 £; ejeksiyon basıncı: 15 psi; Kapılanamaması 100 msn aralığı 1.9 dönemi değeri (10.9 msn karşılık gelir).
  6. % 1.5 ile 20 ml (w / v) jeli oluşturmak için standart bir mikrodalga kullanılarak 1 x PBS içinde agaroz eritin. , 10 cm Petri kabı içine erimiş jel dökün. Sertleştikten sonra, agaroz sedasyon larva 11 (Şekil 2D ve 2E) yerleştirileceği oluklar içinde olacak, böylece sıcak bir yivli agaroz enjeksiyon formu yerleştirin.

4. Enjeksiyonları (Şekil 3)

  1. 20 mg / L tricaine (L-Etil-m-amino-benzoat-metan sülfonat) onlar dokunmak yanıt vermemesine kadar akvaryum suyu 100 ml larva anestezisi.
  2. Plastik bir Pasteur pipett kullanınventral yan oluk (Şekil 3A) dikey agaroz duvara bakacak şekilde e dikkatle ıslak agaroz kalıbın bir oluğuna sedasyon larva aktarmak için kullanılır.
  3. Ventrikül uzak enjeksiyon iğnesi (Şekil 3A) bakacak şekilde stereomikroskop altında agaroz plakası yerleştirin.
  4. Kalbin karıncık içine eklemek için iğne indirin. Sadece 1-2 mikron çok derin iğne (Şekil 3B ve 3C) takmamaya özen ventrikül içine iğne takın.
  5. Iğne takıldıktan sonra, kalbin (Şekil 3D ve 3E) temizlenmesini sağlamak için aralıklarla bekleyen, 4-6 bakliyat, çözümün her sağlayan 3 nl ile ventrikül içine morfolino çözüm enjekte.
  6. Enjeksiyondan sonra, iğne (ekleme düzlemine paralel) kaldırmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde E3 orta BAC dolu plastik bir Pasteur pipeti kullanarak larva aktarmataze E3 ortamı içeren bir Petri kabı içine k.
  7. Enjekte edilen larva aktarırken iğnenin kurumasını önlemek için 1x PBS içeren bir petri kabı içine iğne yerleştirin.
  8. Tekrar 4,1-4,6 deney süresince her 12-24 saat adımları tekrarlayın. Not: enjeksiyon Yinelenen hücrelerdeki morfolino alımını ve bakım sağlar.

5. Enjeksiyonları Analizleri (Şekil 4)

  1. Onlar dokunmak yanıt vermemesine kadar 20 mg / L tricaine akvaryum su 100 ml balık anestezisi.
  2. Düz ıslak% 1.5 üzerinde yanal olarak larva yerleştirin E3 ortam maddesi ile kaplanmış (ağ / hac) agaroz.
  3. Aydınlık ve floresan görüntüleme ile stereomikroskopta kullanarak görüntü larva. Not: larvalar şeffaf olduğu için, floresein-etiketli morfolino doğrudan enjeksiyondan sonra hayvan boyunca kan damarlarında floresan yeşili gibi görünür olmalıdır. Bu floresan ayrıca aşağıdaki diğer vaskülarize doku içine dağılacaktır15 dakika (Şekil 4A-4C).

Rejeneratif kıbet 6. Değerlendirilmesi

  1. Fiji Resim J özgür yazılım (http://fiji.sc/Fiji) kullanılarak çekilen görüntüleri değerlendirmek. Rejenerasyon araştırmak için, kontrol ve morfolinodur enjekte larva oluştu rejeneratif büyüme miktarını belirlemek için hat-izleme aracını kullanın.
  2. Görüntüleri kalibre etmek için, sürükleyerek ve ana Fiji penceresinin içine dosyayı bırakarak Fiji orijinal görüntü dosyalarından birini açın.
  3. Aşağıdaki tüm görüntüler için ölçeğini ayarlamak için, ana menüde "Analiz" gidin.
  4. "Set ölçekte" menüsünü tıklatın Açılır.
  5. Bu pencerede, onay kutusunu tıklatarak "Küresel" seçeneğini açın.
  6. Şimdi sürükle ve bırak (adım 6.1) tekrar rejeneratif büyüme miktarını ölçmek için görüntüyü açın.
  7. Araç çubuğunda "serbest seçimler" aracını seçin.
  8. Ölçülecek alanı (Fi kuşatmakdeerlerini 4J-4L).
  9. Ctrl + M. Bu kare piksel çevrili alanın değerini gösteren yeni bir "Sonuçlar" penceresi açılacaktır.

Sonuçlar

(Şekil 3A) dorsal yaklaştı keskin, eğimli enjeksiyon iğnesi kolayca Zebra balığı larva kalp ventrikül yerleştirilir. Kalp iğne (Şekil 3B ve 3C) varlığına rağmen devam eder ve pompalama kan akışı muhafaza edilmektedir. Dikkatli enjeksiyonları kalp (Şekil 3E) içine morfolino enjeksiyonu rağmen ventrikül veya kalp kasılmaları (Şekil 3D) morfolojisini bozmayacak.

Birkaç dakika içinde...

Tartışmalar

Intraventriküler enjeksiyon Embriyogenez sırasında gen fonksiyonlarını etkilemeden gelişim veya vücut homeostasis ileriki aşamalarında gen fonksiyon testi için hızlı ve güvenilir bir değerlendirme yöntemi sağlar. Bu tekniğin başarı sağlamak için, bir dört kritik noktaların farkında olmalıdır: iğneden 1) iğne boyutu, 2) kurutma, 3) hacmini minimize ve sedasyon çözeltide 4) minimal maruz kalma süresi. Çok büyük iğneler ventrikül zarar ve aşırı kanamaya neden olurken çok küçük iğ...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenen, biz teknik destek için Ayele Tsedeke Taddese teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Morpholino with 3´fluorescein tagGene Tools Inc.CustomizedMore information at www.gene-tools.com
Endo-PorterGene Tools Inc.More information at www.gene-tools.com
AgaroseServa120623For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)ApplichemFor anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)For larval husbandry
Petri DishesSarstedt821.472For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass CapillariesWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-3For preparing injection needles
Microloader pipette tipsEppendorf5,242,956,003For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)Brand747760/ 74775For transfering larva
Flaming/Brown needle pullerSutterMore information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)World Precision Instruments, Inc.501985To brake the needle before sharpening
Dissecting microscopeOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturerPart of the whole injection setup
Fluorescence cameraOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturerTo image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)World Precision Instruments5430-12For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)World Precision InstrumentsSYS-PV820For microinjections

Referanslar

  1. Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  2. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
  3. Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
  4. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
  5. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
  6. Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
  7. Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
  8. Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
  9. Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
  10. Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
  11. Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  13. Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
  15. Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
  16. Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
  17. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  18. Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
  19. Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
  20. Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
  21. McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
  22. Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 88Zebra ballarvarejenerasyonintraventrik ler enjeksiyonkalpmorfolinoknockdownkuyruk y zgeci

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır