Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

Riepilogo

Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.

Abstract

Lo zebrafish è un modello importante per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice. Tuttavia, le strategie molecolari di impiegare genetica inversa non sono ancora stati adeguatamente sviluppati per valutare la funzione del gene nella rigenerazione o omeostasi dei tessuti durante le fasi larvali dopo embriogenesi zebrafish, e diversi tessuti all'interno della larva zebrafish sono difficili da colpire. Iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici offrono un metodo alternativo per l'attuale incapacità di indirizzare genomically geni di zebrafish in modo controllato temporalmente in queste fasi. Questo metodo consente la completa dispersione e successiva incorporazione del morfolino in vari tessuti dell'organismo, comprese le strutture che prima erano impossibili da raggiungere come quelli nella pinna caudale larvale, una struttura spesso usato per ricercare in modo non invasivo rigenerazione tissutale. Diversi geni attivati ​​durante la rigenerazione finfold larvale sono anche Present nella rigenerazione dei tessuti vertebrati adulti, in modo che la larva è un modello utile per capire la rigenerazione negli adulti. Questo metodo dispersione morfolino consente l'identificazione rapida e facile di geni necessari per la rigenerazione di tessuti larvali nonché altri fenomeni fisiologici che regolano l'omeostasi del tessuto dopo l'embriogenesi. Pertanto, questo metodo di consegna fornisce una strategia attualmente necessari per il controllo temporale per la valutazione della funzione genica dopo embriogenesi.

Introduzione

Rigenerazione di organi e appendici è di fondamentale importanza per la sopravvivenza e fitness; Tuttavia, alcuni vertebrati compreso l'uomo hanno limitato la capacità rigenerative. Mentre diversi modelli animali esistere che hanno ampia capacità rigenerativa, invertire tecniche genetiche per valutare la funzione del gene durante organo e la rigenerazione appendice rimangono molto limitato o inesistente. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per sezionare la biologia molecolare di rigenerazione in questi organismi modello.

Il zebrafish è un modello ben consolidato per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice ^1, non solo per la sua notevole capacità di rigenerare più organi, tessuti e appendici, ma anche perché diverse linee transgeniche di pesce esistono per monitorare le cellule e di iperespressione del gene costruisce ^{2, 3.} Tuttavia, l'inibizione del gene in zebrafish larvale è limitata principalmente al overexpreSsion di costrutti dominanti negativi, che non sono a disposizione di tutti i geni di interesse o il cui prodotto del transgene in grado di acquisire il guadagno-di-funzione degli effetti che non riflettono l'attività endogena del gene. Pertanto, è necessario un metodo alternativo per rimuovere specificamente espressione genica per KO o smontabile per superare questi problemi.

Gene-specifica il targeting utilizzando TALENS esiste come un mezzo genetica inversa per knockout funzione del gene; Tuttavia, questa strategia knockout è molto spesso limitata a valutazioni funzionali durante embriogenesi precoce, perché i requisiti iniziali del gene impedire ulteriore progressione dello sviluppo embrionale. Così, studiando i fenomeni successivi come la rigenerazione o organo omeostasi dopo di sviluppo utilizzando TALENS è preclusa ^{4, 5.} Pertanto, è necessaria una strategia di rimozione gene supplente che gli obiettivi di funzione del gene dopo lo sviluppo presto per valutare i requisiti del gene in organi e strutture completamente formate.

Morfolino iniezione ha dimostrato di essere efficace nel rivolti geni in alcuni organi adulti e l'adulto rigenerante pinna ^6-8, ma questi metodi richiedono elettroporazione e molti organi interni sono difficili da elettroporazione sia a causa della loro posizione o per la loro sensibilità elettrica interruzioni. Inoltre, alcuni tessuti del larva sono difficili da iniettare direttamente, perché l'iniezione diretta può compromettere la loro integrità strutturale o perché la loro dimensione è limitante. La pinna caudale della larva è una tale struttura, in quanto l'iniezione diretta nel finfold non è possibile. Così, alternativa alla elettroporazione e iniezione diretta era necessaria per indirizzare geni nei tessuti che sono o troppo piccolo per iniettare o non possono essere elettroporate.

Al fine di indirizzare e inibire la funzione dei geni specifici durante la rigenerazione della pinna caudale larvale, abbiamo modificato morpholino tecnologie esistenti consentendo unVALUTAZIONE della funzione del gene durante la rigenerazione pinna caudale in larva tardo-messa in scena. Questo metodo impiega consegna intraventricolare ⁹ del Morpholinos fluoresceina-tagged con Endo-Porter trasfezione reagente ^10. Una volta nel ventricolo, la miscela morfolino-Endo-Porter diffonde rapidamente in tutto il larva attraverso il sistema vascolare ed entra tessuti che sono stati precedentemente impossibile bersaglio. Questo metodo di iniezione può essere modificato per geni bersaglio in tessuti specifici e molto probabilmente può essere applicato in altri modelli animali che attualmente mancano metodi genetici inverso per inibire la funzione del gene. Così, offre un metodo rapido e facile con la possibilità di ampio utilizzo gamma di studiare immediatamente la funzione del gene durante l'omeostasi organo generale e rigenerazione nelle fasi larvali.

Protocollo

1. Preparazione degli aghi di vetro (Figura 1)

1. Utilizzare capillari di vetro con diametro 0,75 millimetri per preparare aghi per iniezione (Figura 1A).
2. Posizionare il capillare di vetro in un estrattore ago e tirare l'ago con il seguente parametro: valore del ciclo di riscaldamento: 463; tirando valore del ciclo: 230; Velocità: 150 msec; Tempo: 150 msec (Figura 1B).
3. Rompere il capillare di vetro tirato con le pinzette da orologiaio per produrre un diametro ago 20 micron sotto uno stereoscopio con un micrometro.
4. Utilizzare un tornio con una ruota che gira gomma bagnata per affinare l'ago e produrre un 20 micron smusso (figure 1C e 1D). Nota: Sharp, aghi smussati migliorare la facilità di inserimento nel ventricolo e quindi ridurre al minimo il danno al tessuto e consentono il muscolo forata per richiudere dopo la rimozione dell'ago (Figure 1E-G).

2. Preparzione della soluzione Morpholino

1. Preparare il morpholino magazzino sciogliendo la morpholino liofilizzato in 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) ad una concentrazione finale di 7,5 mm. [Riferimento alle istruzioni del produttore per i dettagli (tabella materiali)].
2. Preparare la soluzione iniettabile morfolino mescolando soluzione 2,5 microlitri morfolino magazzino (7,5 mm) con 2,8 ml soluzione Endo-Porter magazzino (1 mm) (vedere la tabella dei materiali) per una concentrazione finale di morfolino 3,5 mm e 0,5 mM Endo-Porter.

3. Preparazione dell'iniezione Morpholino (Figura 2)

1. Caricare l'ago di vetro smussato con 5 ml di questa soluzione utilizzando una micropipetta con 10 microlitri punta microloader pipetta.
2. Inserire l'ago di vetro nel supporto dell'ago del micromanipolatore collegato alla pompa pico pneumatico (figure 2A-C).
3. Posizionare il supporto dell'ago accanto al microscopio in modo che solo le esigenze agodi essere spostati in una direzione planare per inserirla nel ventricolo cardiaco della larva (Figura 2A).
4. Regolare l'angolo per le iniezioni a circa 45 °.
5. Impostare i valori microinjector come segue: pressione di mantenimento: 20 libbre per pollice quadrato (psi); Pressione di espulsione: 15 psi; 100 msec gamma di gating, valore di periodo di 1,9 (corrisponde a 10,9 msec).
6. Sciogliere agarosio in 1x PBS utilizzando un forno standard per produrre 20 ml di 1,5% (w / v) di gel. Versare gel fuso in una capsula Petri 10 centimetri. Posizionare una forma di iniezione scanalato in agarosio caldo in modo che, una volta indurito, il agarosio avrà solchi in cui la larva sedato sarà posto ¹¹ (figure 2D e 2E).

4. Iniezioni (Figura 3)

1. Anestetizzare larva in 100 ml di acqua dell'acquario con 20 mg / L tricaine (L-etil-m-amino-benzoato-metano solfonato) finché smettono di rispondere al tatto.
2. Utilizzare un Pasteur pipett plasticae di trasferire accuratamente la larva sedato in una scanalatura dello stampo agarosio bagnato in modo che il lato ventrale è rivolto contro la parete agarosio verticale della scanalatura (Figura 3A).
3. Posizionare la piastra di agarosio allo stereomicroscopio in modo che il ventricolo è rivolto verso l'ago di iniezione (figura 3A).
4. Abbassare l'ago per inserirlo nel ventricolo del cuore. Inserire l'ago solo 1-2 micron nel ventricolo avendo cura di non inserire l'ago troppo in profondità (Figure 3B e 3C).
5. Una volta inserito l'ago, iniettare la soluzione morfolino nel ventricolo con 4-6 impulsi, ciascuno consegna 3 nl della soluzione, con intervalli di attesa per consentire compensazione del cuore (figure 3D e 3E).
6. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago (parallelo al piano di inserimento) e poi trasferire accuratamente la larva con una pipetta Pasteur plastica riempito di E3 medio BACk in una capsula di Petri contenente mezzo E3 fresco.
7. Posizionare l'ago in una capsula di Petri contenente PBS 1x per impedire l'essiccamento dell'ago quando si trasferisce la larva iniettata.
8. Ripetere i passaggi 4,1-4,6 ogni 12-24 ore per la durata dell'esperimento. Nota: Ripetendo le iniezioni assicura l'assorbimento e la manutenzione del morfolino nelle cellule.

5. Analisi di iniezioni (figura 4)

1. Anestetizzare il pesce in 100 ml di acqua dell'acquario con 20 mg / L tricaine fino a che non smettono di rispondere al tatto.
2. Posizionare la larva lateralmente su un piatto bagnato 1,5% (w / v) piastra di agarosio coperto con E3 medie.
3. Larve di immagine utilizzando uno stereomicroscopio con campo chiaro e imaging di fluorescenza. Nota: Poiché le larve sono trasparenti, il morfolino fluoresceina-tag dovrebbe essere visibile come verde fluorescente nei vasi sanguigni in tutto l'animale immediatamente dopo l'iniezione. Questa fluorescenza ulteriormente disperdere nei tessuti vascolarizzati da15 min (Figure 4A-4C).

6. Valutazione della Regenerative escrescenza

1. Valutare le immagini catturate utilizzando Fiji Immagine software libero J (http://fiji.sc/Fiji). Per indagare la rigenerazione, utilizzare lo strumento di line-analisi per determinare la quantità di crescita rigenerativa che si è verificato sul controllo e la larva morfolino-iniettato.
2. Per calibrare le immagini, aprire uno dei file di immagine originali in Fiji trascinando e rilasciando il file nella finestra principale di Fiji.
3. Per impostare la scala per tutte le immagini che seguono, andare su "Analizza" nel menu principale.
4. Nel menu a discesa fare clic su "Imposta scala".
5. In questa finestra, attivare l'opzione "Global" facendo clic sulla casella di controllo.
6. Ora aprite l'immagine per misurare la quantità di crescita rigenerativa di nuovo con il drag and drop (vedi punto 6.1).
7. Scegliere lo strumento "selezione a mano libera" nella barra degli strumenti.
8. Circondare la zona da misurare (Figure 4J-4L).
9. Premere Ctrl + M. Si aprirà una nuova finestra "Risultati" che mostra il valore dell'area circondata in pixel quadrati.

Risultati

Il forte, smussato ago per l'iniezione è facilmente inserito nel ventricolo cardiaco della larva zebrafish quando si avvicinò dorsale (Figura 3A). Il cuore continua a pompare e il flusso di sangue viene mantenuta nonostante la presenza dell'ago (Figure 3B e 3C). Iniezioni attente non perturbare la morfologia del ventricolo o contrazioni cardiache (Figura 3D) nonostante iniezione del morfolino nel cuore (Figura 3E).

Discussione

L'iniezione intraventricolare fornisce un metodo di valutazione rapida e affidabile per analizzare la funzione genica nelle fasi successive di sviluppo o di omeostasi del corpo senza alterare la funzione del gene durante l'embriogenesi. Per assicurare il successo di questa tecnica, si deve essere consapevoli di quattro punti critici: 1) dimensioni dell'ago, 2) essiccazione dell'ago, 3) minimizzare il volume, e 4) tempo di esposizione minima nella soluzione sedazione. Aghi che sono troppo piccoli saranno ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections