Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

Resumen

Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.

Resumen

El pez cebra es un modelo importante para comprender la biología celular y molecular de la regeneración de órganos y apéndice. Sin embargo, las estrategias moleculares para emplear genética inversa todavía no se han desarrollado adecuadamente para evaluar la función del gen en la regeneración o la homeostasis del tejido durante las etapas de larvas de pez cebra después de la embriogénesis, y varios tejidos dentro de la larva de pez cebra son difíciles de orientar. Inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos ofrecen un método alternativo para la incapacidad actual para apuntar genómicamente genes de pez cebra de una manera controlada temporalmente en estas etapas. Este método permite la dispersión completa y la posterior incorporación de la morfolino en varios tejidos de todo el cuerpo, incluyendo estructuras que antes eran imposibles de alcanzar, tales como los de la aleta caudal de larvas, una estructura a menudo utilizado para investigar de forma no invasiva la regeneración de tejidos. Varios genes activados durante la regeneración pliegue de la aleta larval también se Present en la regeneración de tejidos de vertebrados adultos, por lo que la larva es un modelo útil para entender la regeneración en adultos. Este método de dispersión morfolino permite la identificación rápida y fácil de los genes necesarios para la regeneración de los tejidos de las larvas, así como otros fenómenos fisiológicos que regulan la homeostasis del tejido después de la embriogénesis. Por lo tanto, este método de entrega proporciona una estrategia necesaria en la actualidad para el control temporal de la evaluación de la función de genes después de la embriogénesis.

Introducción

La regeneración de órganos y apéndices es de fundamental importancia para la supervivencia y la aptitud; sin embargo, varios vertebrados, incluido el hombre han limitado las capacidades regenerativas. Aunque existen varios modelos animales que tienen una amplia capacidad de regeneración, las técnicas de genética inversa para evaluar la función de genes durante la regeneración de órganos y apéndices siguen siendo muy limitada o inexistente. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques para diseccionar la biología molecular de la regeneración en estos organismos modelo.

El pez cebra es un modelo bien establecido para la comprensión de la biología celular y molecular de la regeneración de órganos y apéndice ^1, no sólo debido a su capacidad significativa para regenerar múltiples órganos, tejidos y apéndices, sino también porque existen varias líneas de peces transgénicos para rastrear las células y para sobreexpresar genes construye ^{2, 3.} Sin embargo, la inhibición de genes en larvas de pez cebra se limita principalmente a la overexpression de las construcciones dominantes negativos, que no están disponibles para todos los genes de interés o cuyo producto transgénico puede adquirir con ganancia de función de los efectos que no reflejan la actividad endógena del gen. Por lo tanto, se necesita un método alternativo para eliminar específicamente la expresión de genes por knockout o knockdown para superar estos problemas.

Específica la orientación de genes usando TALENS existe como un medio de genética inversa para octavos de final la función de genes; Sin embargo, esta estrategia eliminatoria es muy limitado con frecuencia a evaluaciones funcionales durante la embriogénesis temprana, porque los requisitos iniciales del gen impiden la progresión del desarrollo embrionario. Por lo tanto, el estudio de los fenómenos posteriores como la regeneración o la homeostasis de órganos después de desarrollo utilizando TALENS está impedido ^{4, 5.} Por lo tanto, se necesita una estrategia alternativa de eliminación de genes que se dirige a la función de genes después del desarrollo temprano para evaluar los requisitos de genes en los órganos y estructuras completamente formados.

Morfolino inyección se ha demostrado ser eficaz en la orientación de los genes en un par de órganos de adultos y el adulto regeneración de aleta ^6-8, pero estos métodos requieren la electroporación y muchos órganos internos son difíciles de electroporar ya sea debido a su ubicación o debido a su sensibilidad a eléctrica interrupción. Por otra parte, algunos tejidos de la larva son difíciles de inyectar directamente, ya que la inyección directa puede alterar su integridad estructural o porque su tamaño es limitante. La aleta caudal de la larva es un tal estructura, debido a la inyección directa en el pliegue de la aleta no es posible. Por lo tanto, se necesita una alternativa a la electroporación y la inyección directa de los genes objetivo en los tejidos que son demasiado pequeña para inyectar o no puede ser a electroporación.

Con el fin de dirigir e inhibir la función de genes específicos durante la regeneración de la aleta caudal de larvas, hemos modificado tecnologías de morfolino existentes permitiendo que el unVALUACIÓN de la función génica durante la regeneración de la aleta caudal en larva-etapas finales. Este método emplea la entrega intraventricular ⁹ de morfolinos fluoresceína etiquetado junto con Endo-Porter transfección reactivo ^10. Una vez en el ventrículo, la mezcla morfolino-Endo-Porter se propaga rápidamente a través de la larva a través de la vasculatura y entra en los tejidos que han sido previamente imposible para apuntar. Este método de inyección puede ser modificado para los genes objetivo en tejidos específicos y muy posiblemente puede ser aplicado en otros modelos animales que actualmente carecen de métodos de genética inversa para inhibir la función del gen. Así, se ofrece un método rápido y fácil con el potencial de uso de gama amplia para estudiar de inmediato la función de genes durante la homeostasis de órganos en general y la regeneración en las etapas larvales.

Protocolo

1. Preparación de las agujas de vidrio (Figura 1)

1. Utilice capilares de vidrio con un diámetro de 0,75 mm para preparar agujas de inyección (Figura 1A).
2. Coloque el capilar de vidrio en un extractor de aguja y tire de la aguja con el siguiente parámetro: valor del ciclo de calentamiento: 463; tirando de valor del ciclo: 230; velocidad: 150 mseg; tiempo: 150 ms (Figura 1B).
3. Romper el capilar de vidrio tirado con pinzas de relojero para producir una aguja de 20 m de diámetro bajo un estereoscopio con un ocular micrométrico.
4. Utilice un torno con una rueca de goma mojada para afilar la aguja y producir unas 20 micras de bisel (figuras 1C y 1D). Nota: agudo, agujas biseladas mejorar la facilidad de inserción en el ventrículo y por lo tanto minimizar el daño al tejido y permitir que el músculo perforada para volver a sellar después de la retirada de la aguja (figuras 1E-G).

2. Preparación de la Solución Morpholino

1. Preparar la población de morfolino disolviendo el morfolino liofilizado en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración final de 7,5 mM. [Vea las instrucciones del fabricante para obtener más información (tabla Materiales)].
2. Preparar la solución de inyección morfolino mezclando disolución 2,5 l morfolino acciones (7,5 mM) con 2,8 l solución Endo-Porter de valores (1 mM) (Ver tabla Materiales) para obtener una concentración final de 3,5 mM morfolino y 0,5 mM Endo-Porter.

3. Preparación de la inyección de morfolino (Figura 2)

1. Cargue la aguja de vidrio biselado con 5 l de esta solución utilizando una micropipeta con una punta de pipeta microloader 10 l.
2. Insertar la aguja de vidrio en el soporte de la aguja de la micromanipulador conectada a la bomba neumática Pico (Figuras 2A-C).
3. Coloque el soporte de la aguja al lado del microscopio, de manera que sólo las necesidades de la agujapara moverse en una dirección plana para insertarla en el ventrículo cardíaco de la larva (Figura 2A).
4. Ajuste el ángulo de la inyección en los alrededores de 45 °.
5. Establezca los valores microinyector como sigue: presión de mantenimiento: 20 libras por pulgada cuadrada (psi); presión de expulsión: 15 psi; Alcance de 100 ms de gating, valor del periodo de 1,9 (corresponde a 10,9 ms).
6. Derretir de agarosa en 1x PBS utilizando un horno de microondas estándar para producir 20 ml de un 1,5% (w / v) en gel. Verter en gel fundida en un plato de Petri de 10 cm. Coloque una forma de inyección ranurado en la agarosa caliente para que una vez endurecido, la agarosa tendrá surcos en los que la larva sedado se colocará ¹¹ (Figuras 2D y 2E).

4. Inyecciones (Figura 3)

1. Anestesie larva en 100 ml de agua del acuario con 20 mg / L tricaína (sulfonato L-etil-m-amino-benzoato-metano) hasta que dejan de responder al tacto.
2. Utilice una Pasteur pipetee plásticoe para transferir cuidadosamente la larva sedado en una ranura del molde de agarosa húmeda de modo que el lado ventral se enfrenta contra la pared de agarosa vertical de la ranura (Figura 3A).
3. Coloque la placa de agarosa bajo el microscopio estereoscópico para que el ventrículo está de espaldas a la aguja de inyección (Figura 3A).
4. Baje la aguja para insertarla en el ventrículo del corazón. Inserte la aguja sólo 1-2 micras en el ventrículo teniendo cuidado de no insertar la aguja profundamente (Figuras 3B y 3C).
5. Una vez que se inserta la aguja, se inyecta la solución morfolino al ventrículo con 4-6 pulsos, cada entrega de 3 nl de la solución, con intervalos de espera para permitir la limpieza del corazón (Figuras 3D y 3E).
6. Después de la inyección, retire la aguja (paralelo al plano de la inserción) y, a continuación transferir cuidadosamente la larva usando una pipeta Pasteur de plástico llena de E3 medio BACk en una placa de Petri que contiene medio de E3 fresco.
7. Coloque la aguja en una placa de Petri que contiene PBS 1x para evitar el secado de la aguja cuando la transferencia de la larva inyectado.
8. Repita los pasos 4.1 a 4.6 de cada 12 a 24 horas durante la duración del experimento. Nota: La repetición de las inyecciones asegura la absorción y el mantenimiento de la morfolino en las células.

5. Los análisis de las inyecciones (Figura 4)

1. Anestesiar los peces en 100 ml de agua del acuario con 20 mg / L tricaína hasta que dejan de responder al tacto.
2. Coloque la larva lateralmente en un piso mojado 1,5% (w / v) de agarosa placa de cubierta con medio E3.
3. Larvas de imagen usando un microscopio estereoscópico con campo claro y fluorescencia de imagen. Nota: Como las larvas son transparentes, la fluoresceína morfolino-etiquetado debe ser visible como verde fluorescente en los vasos sanguíneos en todo el animal directamente después de la inyección. Esta fluorescencia se dispersará más en los tejidos vascularizados por15 min (Figuras 4A-4C).

6. Evaluación de Regenerativa excrecencia

1. Evaluar las imágenes capturadas utilizando Fiji Image J software libre (http://fiji.sc/Fiji). Para la investigación de la regeneración, utilice la herramienta de línea de trazado para determinar la cantidad de crecimiento regenerativo que se ha producido en el control y la larva morpholino inyectado.
2. Para calibrar las imágenes, abrir uno de los archivos de imagen originales en Fiji por arrastrar y soltar el archivo en la ventana principal de Fiji.
3. Para definir la escala para todas las siguientes imágenes, vaya a "Analizar" en el menú principal.
4. En el menú desplegable, haga clic en "escala Ajuste".
5. En esta ventana, active la opción "Global" haciendo clic en la casilla de verificación.
6. Ahora abra la imagen para medir la cantidad de crecimiento regenerativo de nuevo por arrastrar y soltar (véase el paso 6.1).
7. Elija la herramienta "selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas.
8. Rodear el área a ser medido (Figuras 4J-4L).
9. Presione Ctrl + M. Esto abrirá una nueva ventana "Resultados" muestra el valor del área cercada en píxeles cuadrados.

Resultados

La aguja de inyección agudo, biselado se coloca fácilmente en el ventrículo cardíaco de la larva de pez cebra cuando se acercó dorsalmente (Figura 3A). El corazón continúa bombeando y se mantiene el flujo de sangre a pesar de la presencia de la aguja (Figuras 3B y 3C). Inyecciones de cuidado no alteran la morfología del ventrículo o contracciones cardíacas (Figura 3D) a pesar de la inyección de la morfolino en el corazón (Figura 3E)....

Discusión

La inyección intraventricular proporciona un método de evaluación rápida y fiable para probar la función de genes en las etapas posteriores del desarrollo o de la homeostasis del cuerpo sin afectar a la función del gen durante la embriogénesis. Para asegurar el éxito de esta técnica, uno debe ser consciente de los cuatro puntos críticos: 1) Tamaño de la aguja, 2) la desecación de la aguja, 3) reducir al mínimo el volumen, y 4) el tiempo mínimo de exposición en la solución de la sedación. Agujas que son ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections