Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

Résumé

Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l'homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène.

Résumé

Le poisson zèbre est un modèle important de comprendre la biologie cellulaire et moléculaire de l'orgue et appendice régénération. Cependant, les stratégies moléculaires pour employer la génétique inverse ne sont pas encore suffisamment développées pour évaluer la fonction d'un gène dans la régénération ou l'homéostasie tissulaire au cours de stades larvaires après l'embryogenèse poisson-zèbre, et de plusieurs tissus dans la larve de poisson zèbre est difficile à cibler. Injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène offrent une méthode alternative pour l'incapacité actuelle à une cible, sur le plan génomique de poisson zèbre gènes d'une manière contrôlée dans le temps à ces stades. Cette méthode permet une dispersion complète et l'incorporation ultérieure de la morpholino dans divers tissus du corps, y compris les structures qui étaient auparavant impossible à atteindre telles que celles de la nageoire caudale larvaire, une structure souvent utilisée pour la recherche de manière non invasive la régénération des tissus. Plusieurs gènes activés au cours des larves régénération finfold sont également présentationt dans la régénération de tissus de vertébrés adulte, si la larve est un modèle utile pour comprendre la régénération chez les adultes. Ce procédé de dispersion morpholino permet l'identification rapide et facile des gènes requis pour la régénération des tissus larvaires ainsi que d'autres phénomènes physiologiques régulant l'homéostasie tissulaire après l'embryogenèse. Par conséquent, ce mode de livraison fournit une stratégie actuellement nécessaires pour le contrôle temporel de l'évaluation de la fonction des gènes après l'embryogenèse.

Introduction

Régénération des organes et des appendices est d'une importance fondamentale pour la survie et remise en forme; Toutefois, plusieurs vertébrés, y compris l'homme ont limité capacités régénératrices. Bien que plusieurs modèles animaux existent qui ont une vaste capacité de régénération, inverser techniques génétiques pour évaluer la fonction des gènes au cours de l'orgue et appendice régénération reste très limitée ou inexistante. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires pour disséquer la biologie moléculaire de la régénération dans ces organismes modèles.

Le poisson zèbre est un modèle bien établi pour la compréhension de la biologie cellulaire et moléculaire de l'orgue et appendice régénération ^1, non seulement en raison de son importante capacité de régénérer plusieurs organes, de tissus et des appendices, mais aussi parce que plusieurs lignes de poissons transgéniques existent pour suivre les cellules et surexpriment le gène construit ^{2, 3.} Cependant, l'inhibition du gène chez le poisson zèbre larves se limite essentiellement à la overexpression de constructions dominants négatifs, qui ne sont pas disponibles pour tous les gènes d'intérêt ou dont le produit transgène peut acquérir un gain de fonction des effets qui ne reflètent pas l'activité endogène du gène. Ainsi, une méthode alternative pour éliminer spécifiquement l'expression des gènes par KO ou effet de choc est nécessaire pour surmonter ces problèmes.

Gène spécifique ciblant l'aide TALENS existe comme un moyen de génétique inverse pour Knockout la fonction des gènes; Toutefois, cette stratégie de knock-out est très souvent limitée à des évaluations fonctionnelles au cours de l'embryogenèse précoce, parce que les exigences initiales du gène empêchent la progression du développement embryonnaire. Ainsi, l'étude des phénomènes ultérieurs tels que la régénération ou l'homéostasie des organes après le développement à l'aide TALENS est exclue ^{4, 5.} Par conséquent, une stratégie d'élimination de gène de remplacement est nécessaire que la fonction du gène cible après le développement précoce d'évaluer les besoins de gènes dans les organes et structures complètement formés.

Morpholino injection a été montré pour être efficace dans le ciblage de gènes dans quelques organes adultes et l'adulte régénération nageoire ^6-8, mais ces méthodes nécessitent l'électroporation et de nombreux organes internes sont difficiles à électroporation soit en raison de leur emplacement ou de leur sensibilité à l'électrique perturbation. En outre, certains tissus de la larve sont difficiles à injecter directement, car l'injection directe peut perturber leur intégrité structurelle ou parce que leur taille est limitant. La nageoire caudale de la chenille est une telle structure, car une injection directe dans le finfold n'est pas possible. Ainsi, une alternative à l'électroporation et l'injection directe a été nécessaire pour cibler des gènes dans des tissus qui sont soit trop petite pour injecter ou ne peut pas être soumis à une électroporation.

Afin de cibler et d'inhiber la fonction de gènes spécifiques au cours de la régénération de la nageoire caudale larvaire, nous avons modifié les technologies existantes permettant morpholino l'unÉVALUATION de la fonction des gènes lors de la régénération de la nageoire caudale dans larve de fin de mise en scène. Cette méthode emploie livraison intraventriculaire ⁹ de marqué à la fluorescéine morpholinos avec Endo-Porter réactif de transfection ^10. Une fois dans le ventricule, le mélange morpholino-Endo-Porter se propage rapidement à travers la larve via le système vasculaire et pénètre dans les tissus qui ont été auparavant impossible à cibler. Cette méthode d'injection peut être modifié pour cibler des gènes dans des tissus spécifiques et très probablement peut être appliquée dans d'autres modèles animaux qui n'ont pas actuellement de méthodes de génétique inverse pour inhiber la fonction des gènes. Ainsi, il offre une méthode rapide et facile avec le potentiel pour une large utilisation de la gamme d'étudier immédiatement la fonction des gènes au cours de l'homéostasie des organes général et la régénération au stade larvaire.

Protocole

Une. Préparation des aiguilles de verre (Figure 1)

1. Utiliser des capillaires en verre d'un diamètre de 0,75 mm pour préparer des aiguilles d'injection (Figure 1A).
2. Placer le capillaire de verre dans un extracteur d'aiguille et retirez l'aiguille avec le paramètre suivant: valeur du cycle de chauffage: 463; tirant valeur du cycle: 230; vitesse: 150 ms; temps: 150 ms (figure 1B).
3. Briser le capillaire en verre tiré avec des pincettes horloger pour produire une aiguille 20 um de diamètre sous un stéréoscope avec un micromètre oculaire.
4. Utilisez un tour avec un rouet de caoutchouc mouillée pour aiguiser l'aiguille et produire un biseau 20 um (figures 1C et 1D). Remarque: Sharp, aiguilles biseautées améliorer la facilité d'insertion dans le ventricule et de minimiser ainsi les dommages aux tissus et autorisent le muscle perforé pour resceller après le retrait de l'aiguille (figures 1E-G).

2. Preparation de la solution morpholino

1. Préparer le morpholino en dissolvant le morpholino lyophilisée en 1x tampon phosphate salin (PBS) à une concentration finale de 7,5 mM. [Voir les instructions du fabricant pour plus de détails (de table Matériaux)].
2. Préparer la solution d'injection de morpholino par mélange d'une solution de 2,5 pi morpholino d'actions (7,5 mM) avec Endo-Porter solution stock de 2,8 pi (1 mM) (Voir le tableau des matériaux) pour une concentration finale de morpholino 3,5 mM et 0,5 mM Endo-Porter.

3. Préparation du morpholino injection (figure 2)

1. Chargez l'aiguille de verre biseauté avec 5 pi de cette solution à l'aide d'une micropipette avec une pointe de pipette microloader de 10 pi.
2. Insérer l'aiguille de verre dans le porte-aiguille de la micro-manipulateur relié à la pompe de pico pneumatique (figures 2A-C).
3. Placez le porte-aiguille à côté du microscope afin que l'aiguille seulement les besoinspour être déplacée dans une direction plane de l'insérer dans le ventricule cardiaque de la chenille (figure 2A).
4. Ajustez l'angle pour les injections à environ 45 °.
5. Définissez les valeurs de micro-injecteur comme suit: pression de maintien: 20 livres par pouce carré (psi); pression d'éjection: 15 psi; 100 msec gamme de déclenchement, la valeur de période de 1,9 (correspondant à 10,9 ms).
6. Faire fondre l'agarose dans du PBS 1x en utilisant un four micro-ondes standard pour produire 20 ml d'un 1,5% (p / v) de gel. Verser gel fondu dans une boîte de 10 cm de Pétri. Placez une forme d'injection à gorge dans la gélose chaud de sorte qu'une fois durcie, la gélose aura sillons dans lesquels la larve sous sédation sera placé ¹¹ (figures 2D et 2E).

4. Injections (Figure 3)

1. Anesthésier larve dans 100 ml d'eau de l'aquarium avec 20 mg / L tricaïne (L-éthyl-m-amino-benzoate-méthane sulfonate) jusqu'à ce qu'ils cessent de répondre au toucher.
2. Utilisez une pipett Pasteur en plastiquee pour transférer soigneusement la larve sédation dans une rainure du moule agarose humide de sorte que la face ventrale est confronté contre la paroi verticale de la rainure d'agarose (figure 3A).
3. Placer la plaque d'agarose sous la loupe binoculaire de telle sorte que le ventricule n'est pas tourné vers l'aiguille d'injection (figure 3A).
4. Abaissez l'aiguille pour l'insérer dans le ventricule cardiaque. Insérez l'aiguille seulement 1-2 pm dans le ventricule en prenant soin de ne pas insérer l'aiguille trop profondément (figures 3B et 3C).
5. Une fois que l'aiguille est insérée, injecter la solution de morpholino dans le ventricule avec 4-6 impulsions, chaque 3 nl délivrant de la solution, avec des intervalles d'attente pour permettre la compensation du coeur (Figures 3D et 3E).
6. Après l'injection, retirez l'aiguille (parallèle au plan de l'insertion), puis transférer avec soin la larve à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique rempli de E3 milieu back dans une boîte de Petri contenant un milieu de E3 frais.
7. Placer l'aiguille dans une boîte de Petri contenant du PBS 1x pour empêcher le séchage de l'aiguille lors du transfert de la larve injecté.
8. Répétez les étapes 4.1 à 4.6 tous les 12-24 heures pour la durée de l'expérience. Remarque: La répétition des injections assure la fixation et le maintien de la morpholino dans les cellules.

5. Analyses des injections (figure 4)

1. Anesthésier le poisson dans 100 ml d'eau de l'aquarium avec 20 mg / L tricaine jusqu'à ce qu'ils cessent de répondre au toucher.
2. Placez la larve latéralement sur un plat humide de 1,5% (p / v) d'agarose plaque recouverte de milieu E3.
3. larves de l'image en utilisant un stéréomicroscope clair et l'imagerie de fluorescence. Remarque: Comme les larves sont transparentes, le morpholino-fluorescéine marqué devrait être visible que le vert fluorescent dans les vaisseaux sanguins dans tout l'animal immédiatement après l'injection. Cette fluorescence va encore se disperser dans les tissus vascularisés par15 min (Figures 4A-4C).

6. Évaluation de la médecine régénérative excroissance

1. Évaluer les images capturées à l'aide Fidji Image J logiciel libre (http://fiji.sc/Fiji). Pour enquêter sur la régénération, utilisez l'outil de ligne de traçage pour déterminer le montant de la croissance régénératrice qui a eu lieu sur le contrôle et la larve de morpholino-injecté.
2. Pour calibrer les images, ouvrez l'un des fichiers d'image d'origine à Fidji en faisant glisser le fichier dans la fenêtre principale de Fidji.
3. Pour définir l'échelle de toutes les images suivantes, allez dans "Analyser" dans le menu principal.
4. Dans le menu déroulant, cliquez sur "Définir échelle".
5. Dans cette fenêtre, activez l'option «Global» en cliquant sur la case à cocher.
6. Maintenant, ouvrez l'image pour mesurer la quantité de la croissance régénératrice encore par glisser-déposer (voir l'étape 6.1).
7. Choisissez l'option "sélections à main levée" outil dans la barre d'outils.
8. Entourer la zone à mesurer (Figures 4J-4L).
9. Appuyez sur Ctrl + M. Cela va ouvrir une nouvelle fenêtre «Résultats» montrant la valeur de la zone encerclée en pixels carrés.

Résultats

L'aiguille d'injection biseauté forte est facilement placé dans le ventricule cardiaque de la larve de poisson zèbre lorsqu'il est sollicité dorsale (figure 3A). Le cœur continue pompage et la circulation sanguine est maintenue en dépit de la présence de l'aiguille (Figures 3B et 3C). Injections prudents ne perturbent pas la morphologie du ventricule ou les contractions cardiaques (figure 3D) malgré l'injection du morpholino ...

Discussion

L'injection intraventriculaire fournit une méthode d'évaluation rapide et fiable pour tester la fonction des gènes à des stades ultérieurs du développement ou de l'homéostasie du corps sans affecter la fonction des gènes au cours de l'embryogenèse. Pour assurer le succès de cette technique, il faut être conscient de quatre points essentiels: 1) la taille de l'aiguille, 2) le séchage de l'aiguille, 3) réduire au minimum le volume, et 4) la durée d'exposition minimale à la soluti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections