Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

Resumo

Um método de genética reversa adaptável para peixe-zebra para avaliar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento e homeostase fisiológica, como a regeneração do tecido usando injeções intraventricular de morpholinos gene-específicos.

Resumo

O peixe-zebra é um modelo importante para entender a biologia celular e molecular do órgão e regeneração apêndice. Contudo, as estratégias moleculares para empregar genética reversa ainda não foram adequadamente desenvolvidos para avaliar a função do gene em regeneração ou homeostase do tecido durante a fase larval após embriogênese peixe-zebra, e vários tecidos dentro do larva zebrafish são difíceis de atingir. Injecções intraventriculares morpholinos gene-específicos oferecer um método alternativo para a actual incapacidade para alvejar genes genomicamente de peixes-zebra de uma forma temporal controlada nestas fases. Este método permite a completa dispersão e subsequente incorporação da morfolino em diversos tecidos em todo o corpo, incluindo as estruturas que eram anteriormente impossíveis de alcançar, tais como os do caudal das larvas, de uma estrutura, muitas vezes utilizados para pesquisar de forma não invasiva a regeneração do tecido. Vários genes ativados durante a regeneração membrana embrionária larval também são apresent na regeneração de tecidos adultos de vertebrados, de modo a larva é um modelo útil para compreender a regeneração em adultos. Este método de dispersão morfolino permite a identificação rápida e fácil dos genes necessários para a regeneração dos tecidos das larvas, bem como outros fenómenos fisiológicos que regulam a homeostase do tecido após a embriogénese. Portanto, este método de entrega fornece uma estratégia atualmente necessário para controle temporal para a avaliação da função do gene após a embriogênese.

Introdução

A regeneração de órgãos e apêndices é de fundamental importância para a sobrevivência e fitness; no entanto, vários vertebrados, incluindo o homem limitaram capacidades regenerativas. Embora existam vários modelos animais que têm ampla capacidade regenerativa, inverter técnicas genéticas para avaliar a função do gene durante o órgão e regeneração apêndice continuam a ser muito limitada ou inexistente. Por conseguinte, novas abordagens são necessárias para dissecar a biologia molecular de regeneração nestes organismos modelo.

O peixe-zebra é um modelo bem estabelecido para a compreensão da biologia celular e molecular do órgão e regeneração apêndice ^1, não só devido à sua significativa capacidade de regenerar vários órgãos, tecidos e apêndices, mas também porque existem várias linhas de peixes transgênicos para rastrear células e para sobre-expressar genes constrói ^{2, 3.} No entanto, a inibição do gene em peixes-zebra larval é limitada principalmente ao overexpression de construções dominantes-negativas, que não estão disponíveis para todos os genes de interesse ou cujo produto transgene pode adquirir efeitos ganho de função que não refletem a atividade endógena do gene. Assim, um método alternativo para remover especificamente expressão gênica por nocaute ou nocaute é necessária para superar esses problemas.

Específica do gene alvo usando TALENS existe como um meio genéticos reversa para nocautear a função do gene; no entanto, esta estratégia de nocaute é muito frequentemente limitado a avaliação funcional durante a embriogênese cedo, porque os requisitos iniciais do gene impedir a progressão do desenvolvimento embrionário. Assim, o estudo de fenômenos posteriores, como a regeneração ou a homeostase do órgão após o desenvolvimento usando TALENS é impedida ^{4, 5.} Portanto, uma estratégia alternativa de remoção de gene é necessário que atinge a função do gene após o desenvolvimento cedo para avaliar os requisitos de genes em órgãos e estruturas totalmente formados.

Morfolino injecção foi demonstrado ser eficaz no direccionamento de genes em alguns órgãos adultos e adultos regenerar barbatana ^6-8, mas estes métodos requerem a electroporação e muitos órgãos internos são difíceis para electroporar, quer devido à sua localização, ou devido à sua sensibilidade à eléctrica perturbação. Além disso, alguns tecidos, em que a larva são difíceis de administrar directamente, devido à injecção directa pode perturbar a sua integridade estrutural ou porque o seu tamanho é limitante. O caudal da larva é uma estrutura deste tipo, porque a injecção directa na membrana embrionária não é possível. Assim, foi necessária uma alternativa para eletroporação e injeção direta para atingir genes em tecidos que são demasiado pequenos para injetar ou não pode ser eletroporados.

A fim de orientar e inibir a função de genes específicos durante a regeneração da nadadeira caudal larval, modificamos tecnologias morpholino existentes permitindo a umAVALIAÇÃO da função do gene durante a regeneração da nadadeira caudal em larva late-encenado. Este método emprega entrega intraventricular ⁹ de fluoresceína-marcado morpholinos juntamente com Endo-Porter reagente de transfecção ^10. Uma vez no interior do ventrículo, a mistura de morfolino-Endo-Porter espalha-se rapidamente por toda a larva através da vasculatura e entra tecidos que tenham sido previamente impossível de atingir. Este método de injecção pode ser modificado para alvejar genes em tecidos específicos e, possivelmente, pode ser aplicado em outros modelos animais, que não têm ainda métodos de genética inversa para inibir a função do gene. Assim, oferece um método rápido e fácil com o potencial para uso amplo leque de estudar imediatamente a função do gene durante a homeostase órgão geral e regeneração em estágios larvais.

Protocolo

1. Preparação das agulhas de vidro (Figura 1)

1. Use capilares de vidro com um diâmetro 0,75 milímetros para preparar as agulhas de injeção (Figura 1A).
2. Colocar o capilar de vidro, em um extrator de agulha e puxe a agulha com o seguinte parâmetro: valor ciclo de aquecimento: 463; puxando valor ciclo: 230; velocidade: 150 ms; tempo: 150 mseg (Figura 1B).
3. Quebre o capilar de vidro puxado com uma pinça relojoeiro para produzir uma agulha de 20 um de diâmetro sob um estereoscópio com uma ocular micrométrica.
4. Use um torno com uma roda de fiar de borracha molhada para aguçar a agulha e produzir a 20 mM bisel (Figuras 1C e 1D). Nota: Sharp, agulhas biseladas melhorar a facilidade de inserção no interior do ventrículo e, portanto, minimizar o dano ao tecido e permite que o músculo perfurada para selar após a remoção da agulha (figuras 1E-G).

2. Preparção da Solução Morfolino

1. Prepare o estoque morfolino dissolvendo o morfolino liofilizado em 1x com fosfato tamponado salino (PBS) a uma concentração final de 7,5 mM. [Veja as instruções do fabricante para obter mais detalhes (tabela Materiais)].
2. Preparar a solução de injeção morfolino misturando solução estoque morfolino 2,5 mL (7,5 mM) com 2,8 mL solução Endo-Porter estoque (1 mM) (Ver tabela de materiais) para uma concentração final de 3,5 mM morfolino e 0,5 mM Endo-Porter.

3. Preparação de Injecção Morfolino (Figura 2)

1. Coloque a agulha de vidro chanfrado com 5 mL desta solução, utilizando uma micropipeta com a 10 mL microloader ponteira.
2. Inserir a agulha de vidro no suporte de agulha do micromanipulador ligado à bomba de pico pneumático (Figuras 2A-C).
3. Coloque o suporte da agulha ao lado do microscópio de modo que a agulha apenas as necessidadespara ser movido numa direcção planar a inseri-lo no interior do ventrículo cardíaco da larva (Figura 2A).
4. Ajuste o ângulo para as injeções em torno de 45 °.
5. Defina os valores microinjetor como segue: pressão de recalque: 20 libras por polegada quadrada (psi); pressão de ejeção: 15 psi; 100 ms gama de gating, valor do período de 1,9 (corresponde a 10,9 ms).
6. Melt agarose em 1x PBS utilizando um forno de microondas padrão para produzir 20 ml de 1,5% (w / v) de gel. Despeje gel derretido em um prato de 10 centímetros de Petri. Coloque uma forma de injeção ranhuras no agarose quente, de modo que uma vez endurecido, o agarose terá sulcos em que a larva sedado serão colocados ¹¹ (Figuras 2D e 2E).

4. Injecções (Figura 3)

1. Anestesiar larva em 100 ml de água do aquário com 20 mg / L tricaina (sulfonato L-etil-m-amino-benzoato de-metano) até que pare de responder ao toque.
2. Use uma pipeta Pasteur de plásticoe transferir cuidadosamente a larva sedado dentro de uma ranhura do molde de agarose molhado de modo que o lado ventral está virada contra a parede vertical do sulco de agarose (Figura 3A).
3. Colocar a placa de agarose sob o microscópio estereoscópico, de modo que o ventrículo está voltado para fora a partir da agulha de injecção (Figura 3A).
4. Abaixe a agulha para inseri-lo para o ventrículo cardíaco. Insira a agulha apenas 1-2 mM para o ventrículo tomando cuidado para não inserir a agulha muito profundamente (Figura 3B e 3C).
5. Uma vez que a agulha é inserida, injectar a solução de morfolino no ventrículo com 4-6 pulsos, cada um fornecendo 3 nl da solução, com intervalos de espera para permitir a compensação do coração (Figuras 3D e 3E).
6. Após a injecção, retirar a agulha (paralelo ao plano de inserção) e, em seguida, transferir cuidadosamente a larva usando uma pipeta de Pasteur de plástico cheio com meio E3 back em uma placa de Petri contendo meio fresco E3.
7. Coloque a agulha em uma placa de Petri contendo 1x PBS para impedir a secagem da agulha durante a transferência da larva injectado.
8. Repita os passos 4,1-4,6 cada 12-24 horas, para a duração da experiência. Nota: Repetindo as injecções assegura a captação e manutenção da morfolino em células.

5. Análises de injecções (Figura 4)

1. Anestesiar os peixes em 100 ml de água do aquário com 20 mg / L tricaina até que parar de responder ao toque.
2. Coloque a larva lateralmente em uma superfície plana molhada 1,5% (w / v) placa de agarose cobertas com meio E3.
3. Larvas de imagem usando um microscópio estereoscópico com claro e imagens de fluorescência. Observação: Como as larvas são transparentes, o morfolino marcado com fluoresceína deve ser visível como verde fluorescente nos vasos sanguíneos em todo o animal imediatamente após a injecção. Esta fluorescência irá dispersar ainda mais nos tecidos vascularizados pela15 minutos (Figuras 4A-4C).

6. Avaliação da Regenerativa Conseqüência

1. Avaliar as imagens capturadas usando Fiji Imagem J software livre (http://fiji.sc/Fiji). Para investigar a regeneração, use a ferramenta de rastreamento de linha para determinar a quantidade de crescimento regenerativo que ocorreu em controle e injeção de larva morfolino.
2. Para calibrar imagens, abrir um dos arquivos de imagem originais em Fiji por arrastar e soltar o arquivo para a janela principal de Fiji.
3. Para definir a escala para todas as imagens a seguir, vá para "Analisar" no menu principal.
4. No menu drop-down, clique em "Definir escala".
5. Nesta janela, ative a opção "Global", clicando na caixa de seleção.
6. Agora, abra a imagem para medir a quantidade de crescimento regenerativo novamente por arrastar e soltar (veja o passo 6.1).
7. Escolha a ferramenta "seleções à mão livre" na barra de ferramentas.
8. Cercar a área a ser medida (Figuras 4J-4D).
9. Pressione Ctrl + M. Isto irá abrir uma nova janela "Results", mostrando o valor da área cercada em pixels quadrados.

Resultados

O forte, agulha de injeção chanfrado é facilmente colocado no ventrículo cardíaco da larva zebrafish quando foi abordado dorsal (Figura 3A). O coração continua a bombear e o fluxo de sangue é mantido apesar da presença da agulha (figuras 3B e 3C). Injeções cuidadosas não perturbar a morfologia do ventrículo ou contrações cardíacas (Figura 3D), apesar de a injeção do morfolino para o coração (Figura 3E).

Discussão

A injeção intraventricular fornece um método de avaliação rápida e confiável para testar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento ou da homeostase corporal sem afetar a função dos genes durante a embriogênese. Para garantir o sucesso desta técnica, deve-se estar ciente de quatro pontos fundamentais: 1) tamanho da agulha, 2) secagem para fora da agulha, 3) minimizar o volume, e 4) tempo de exposição mínimo na solução de sedação. Agulhas que são demasiado pequenos vai entupir com freq?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections