Реверс Генетическая Морфолино подход с использованием Сердечная желудочка Injection для трансфекции нескольких трудных для тканей-мишеней в данио рерио Личинка

Резюме

Адаптируется обратная генетический метод для рыбок данио, чтобы оценить функции генов во время более поздних стадиях развития и физиологического гомеостаза, таких как регенерации тканей с использованием внутрижелудочковое инъекции гена конкретных Morpholinos.

Аннотация

Данио является важной моделью для понимания клеточной и молекулярной биологии из органа и регенерации придаток. Однако молекулярные стратегии используют обратной генетики еще не были адекватно разработаны для оценки функции гена в регенерации или тканевого гомеостаза во время личиночной стадии после данио эмбриогенеза, и несколько тканей внутри данио личинки трудно цели. Внутрижелудочковые инъекции гена конкретных Morpholinos предложить альтернативный метод для текущего неспособности геномно генов-мишеней данио в временно контролируемым образом на этих этапах. Этот метод позволяет полностью дисперсии и последующей инкорпорации морфолино в различных тканях организма, в том числе структур, которые раньше были невозможно достичь таких, как в личиночной хвостового плавника, структуры часто используется для неинвазивного исследования регенерации тканей. Некоторые гены активированные во время личиночной регенерации finfold также изложет в регенерации тканей взрослых позвоночных, так что личинка является полезной моделью для понимания регенерации у взрослых. Этот метод морфолино дисперсии позволяет быстро и легкой идентификации генов, необходимых для регенерации тканей личинки, а также других физиологических феноменов, регулирующих тканевого гомеостаза после эмбриогенеза. Таким образом, этот способ доставки обеспечивает в настоящее время необходимо стратегию временного контроля к оценке функции гена после эмбриогенеза.

Введение

Регенерация органов и придатков принципиально важно для выживания и фитнеса; однако, несколько позвоночные, включая человека имеют ограниченный регенеративные способности. В то время как несколько моделей животных существуют, которые имеют большой регенеративную способность, обратный генетические методы для оценки функции гена во органа и регенерации придаток остаются весьма ограничены или вообще отсутствуют. Поэтому необходимы новые подходы препарировать молекулярной биологии регенерации в этих модельных организмов.

Данио является хорошо известной моделью для понимания клеточной и молекулярной биологии органной и придаток регенерации ^1, не только из-за его значительной способности регенерировать несколько органов, тканей и придатков, но и потому, что несколько трансгенные рыбы линии существуют, чтобы отслеживать клетки и для сверхэкспрессии гена конструкции ^{2, 3.} Однако ингибирование генов в личиночной данио в основном ограничивается overexpression доминантных-отрицательных конструкций, которые не доступны для всех интересующих генов или чьи трансгенный продукт может приобрести усиления из-функции эффектов, которые не отражают эндогенный активность гена. Таким образом, альтернативный метод для удаления конкретно экспрессию гена нокаутом или нокдауна, чтобы преодолеть эти проблемы.

Джин конкретных таргетинга с помощью TALENS существует в качестве обратного генетических средств нокаутом функции гена; Однако, эта стратегия нокаут очень часто ограничивается функциональных оценок в ходе раннего эмбриогенеза, потому первоначальные требования гена предотвратить дальнейшее прогрессирование эмбрионального развития. Таким образом, изучение поздние явления, такие как регенерации или органа гомеостаза после разработки с использованием Talens исключается ^{4, 5.} Таким образом, альтернативный стратегия удаление гена необходим, что цели функции гена после раннего развития для оценки потребностей генов в полностью сформированных органов и структур.

Морфолино инъекции, как было показано, чтобы быть эффективным в ориентации генов в несколько органов взрослых и взрослых регенерации ребра ^6-8, однако эти методы требуют электропорацию и многие внутренние органы трудно электропорации либо из-за их расположения или из-за их чувствительности к электрической нарушение. Кроме того, некоторые ткани в личинки трудно придать непосредственно, потому что прямой впрыск может нарушить их структурную целостность или потому, что их размер ограничивает. Хвостовой плавник личинки является одним из таких структура, потому что прямой впрыск в finfold невозможно. Таким образом, альтернативой электропорации и непосредственным впрыском было необходимо, чтобы гены-мишени в тканях, которые либо слишком малы, чтобы придать или не может быть электропорации.

В целях выявления и ингибировать функцию специфических генов при регенерации личиночной хвостового плавника, мы изменили существующие технологии морфолино позволяяssessment функции генов в процессе хвостового плавника регенерации в конце-поставил личинки. Этот метод использует внутрижелудочковую доставку ⁹ флуоресцеина с метками Morpholinos вместе с Эндо-Портера трансфекции реагента ^10. После того, как в желудочке, смесь морфолино-Эндо-Porter быстро распространяется по всей личинки через сосудистую и входит тканей, которые были ранее невозможно цели. Этот метод инъекции может быть изменен, чтобы генов-мишеней в конкретных тканях и, вполне возможно, могут быть применены в других моделях на животных, которые в настоящее время отсутствуют обратные генетические методы, чтобы ингибировать функцию гена. Таким образом, он предлагает быстрый и простой способ с потенциалом для широкого использования диапазона немедленно изучения функции генов во время общей гомеостаза органов и регенерации в личиночной стадии.

протокол

1. Подготовка стекла иглы (рис. 1)

1. Используйте стеклянные капилляры диаметром 0,75 мм для подготовки инъекционных игл (рис. 1а).
2. Поместите стеклянный капилляр в иглы съемник и вытащить иглу со следующим параметром: значение цикла нагрева: 463; потянув значение цикла: 230; скорость: 150 мс; время: 150 мс (рис. 1В).
3. Перерыв вытащил стеклянный капилляр с часовщик пинцетом для получения диаметр иглы 20 мкм под стереоскоп с микрометрическим окуляром.
4. Используйте станок с увлажненной резины прялкой точить иглу и производят 20 мкм скос (рис. 1В и 1Г). Примечание: Sharp, скошенные иглы улучшить простоту вставки в желудочке и таким образом свести к минимуму повреждение ткани и позволяют перфорированный мышцы запечатать после удаления иглы (рис. 1E-G).

2. Подгоной работы решения морфолино

1. Подготовьте морфолино запас растворением лиофилизированного морфолино в 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) до конечной концентрации 7,5 мМ. [См. инструкции производителя для деталей (материалы таблицу)].
2. Приготовьте раствор для инъекций морфолино путем смешивания 2,5 мкл морфолино маточного раствора (7,5 мм) с 2,8 мкл Эндо-Портера исходного раствора (1 мм) (см. таблицу материалы) для конечной концентрации 3,5 мМ морфолино и 0,5 мМ Эндо-Porter.

3. Подготовка инъекций морфолино (рис. 2)

1. Загрузите скошенной стеклянной иглу с 5 мкл этого раствора с помощью микропипетки с 10 мкл microloader кончика пипетки с.
2. Вставьте стеклянную иглу в иглодержатель в микроманипулятором, подключенного к пневматическому пико насоса (фиг.2А-С).
3. Поместите держатель иглы рядом с микроскопом так, чтобы игла только потребностидля перемещения в одном плоском направлении, чтобы вставить его в желудочек сердца личинки (рис. 2А).
4. Отрегулируйте угол для инъекций на отметке 45 °.
5. Установите значения microinjector следующим образом: держать давление: 20 фунтов на квадратный дюйм (пси); давление выброса: 15 фунтов на квадратный дюйм; 100 мс диапазон стробирования, период значение 1,9 (соответствует 10,9 мс).
6. Расплава агарозы в 1х PBS с использованием стандартного микроволновую печь, чтобы произвести 20 мл 1,5% (вес / объем) геле. Налейте расплавленный гель в блюдо 10 см Петри. Наведите рифленую форму впрыска в теплую агарозы, чтобы после затвердевания агарозы будет борозды, в которых в отключке личинка будут размещены ¹¹ (рис. 2D и 2E).

4. Инъекции (рис. 3)

1. Обезболить личинку в 100 мл аквариумной воды с 20 мг / л Tricaine (L-этил-м-амино-бензоат-метансульфоната), пока они не перестают отвечать на ощупь.
2. С помощью пластиковой Пастера pipettе тщательно передавать седативные личинку в паз мокрой агарозном пресс-формы таким образом, что брюшная сторона обращена к вертикальной агарозном стенки канавки (фиг.3А).
3. Поместите агарозном пластину под стереомикроскопа таким образом, чтобы желудочек, обращенной от инъекционной иглы (фиг.3А).
4. Опустите иглу, чтобы вставить его в желудочка сердца. Вставьте иглу только 1-2 мкм в желудочке, стараясь не вставить иглу слишком глубоко (рис. 3В и 3С).
5. После того, как игла вводится, впрыснуть морфолиновое решение в желудочек с 4-6 импульсов, каждый доставки 3 нл раствора, с ожиданием интервалы, чтобы расчистку сердца (Цифры 3D и 3E).
6. После инъекции удалить иглу (параллельно плоскости вставки), а затем тщательно передачи личинку с использованием пипетки Пастера пластик, заполненный E3 среднего бактерийК в чашку Петри, содержащую свежий E3 среду.
7. Поместите иглу в чашку Петри, содержащую 1X PBS, чтобы предотвратить высыхание иглы при передаче введенного личинки.
8. Повторите шаги 4.1-4.6 каждый 12-24 час в течение всего срока эксперимента. Примечание: Повторяя инъекции обеспечивает поглощение и поддержание морфолино в клетках.

5. Анализ инъекций (рис. 4)

1. Обезболить рыбу в 100 мл аквариумной воды с 20 мг / л Tricaine, пока они не перестают отвечать на ощупь.
2. Поместите личинку в поперечном направлении на плоской влажной 1,5% (вес / объем) агарозном пластина покрыта E3 среды.
3. Личинки изображения с использованием стереомикроскопа с светлого и флуоресцентных изображений. Примечание: Как личинки прозрачны, флуоресцеина с метками морфолино должны быть видны как флуоресцентный зеленый в кровеносных сосудах в течение всего животного непосредственно после инъекции. Это флуоресценции будет дальше разогнать в васкуляризированных тканей15 мин (фиг.4А-4С).

6. Оценка регенеративной вырост

1. Оценить отснятые изображения с помощью Фиджи изображения J бесплатное программное обеспечение (http://fiji.sc/Fiji). Для исследования регенерации, используйте инструмент строки-трассировку, чтобы определить количество восстановительного роста, который произошел на контроле и морфолинозамещенной вводят личинки.
2. Для калибровки изображения, открыть один из оригинальных файлов изображений в Фиджи, перетаскивая файл в главное окно Фиджи.
3. Чтобы установить масштаб для всех следующих изображений, перейдите в раздел "Анализ" в главном меню.
4. В выпадающем меню выберите "Установить масштабе".
5. В этом окне включите опцию "Глобал", нажав на флажок.
6. Теперь откройте изображение, чтобы измерить количество восстановительного роста снова путем перетаскивания (см. шаг 6.1).
7. Выберите "от руки Выборки" инструмент на панели инструментов.
8. Окружите область, которая будет измеренное (FiГюреш 4J-4L).
9. Нажмите Ctrl + М. Это откроет новое окно «Результаты», показывающий значение окруженной области в квадратных пикселей.

Результаты

Резкое, скошенные инъекционной иглы легко размещены в желудочек сердца данио личинки при приближении дорсально (фиг.3А). Сердце продолжает накачки и кровоток поддерживается, несмотря на присутствие иглы (фиг. 3В и 3С). Тщательные инъекции не нарушают морфологи...

Обсуждение

Внутрижелудочковое впрыска обеспечивает быстрый и надежный метод оценки для тестирования функции гена на более поздних стадиях развития или боди гомеостаза, не влияя на функцию гена во время эмбриогенеза. Для обеспечения успеха этого метода, следует иметь в виду из четырех критическ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections