药品监督管理局多个斑马鱼的新方法（<em&gt;斑马鱼</em&gt;）和退出的量化

摘要

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

摘要

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

引言

斑马鱼（ 斑马鱼）是一个小的硬骨鱼类物种原产于印度是一个有用的模式生物行为¹和医学研究^2,3。斑马鱼也常用于各种药理物质的检测，以表征其对行为的影响。不同剂量和给药时间表已经被用于研究斑马鱼的，如兴奋剂^4，抗焦虑药⁵和乙醇^6-8化合物给药后的行为。

我们的实验室已调查的充分验证的光/暗检测^9,20，通常也被称为scototaxic测定不同乙醇给药时间表对斑马鱼焦虑和运动的影响。开发乙醇给药的新方法，以提高效率为重复，日常管理过的很长一段时间（21天^）6 。以前使用的方法是实用的，但是，我们试图开发一种方法，该方法减少了网，而其相关联的时间成本，并允许感兴趣的大量鱼的药物的同时，精确地定时给药。在传统的使用研究乙醇中，斑马鱼网状，并从一个罐转移到另一个含有乙醇和水^10-12相应的混合物。虽然这种方法是被广泛接受的，扣除斑马鱼可能增加的可变性中引入和从药液去除鱼所需要的时间。因此，精确的曝光于所关注的化合物可能会发生变化对涉及重复给药的实验过程。一种方法是减少错误的变性运输时间所产生的来源是这样希望的。用我们的方法，我们能够同时移动所有的鱼，导致鱼的每一个相同的给药时间。以下乙醇曝光（此处描述的），斑马鱼可以在任何numbe被测试- [R行为测定法，包括那些评估焦虑。使用新的方法给药鱼群体已经超越精确复制和学科之间和整个鱼类群体规范计量能力的实际用途。新软件的出现，允许多个鱼的跟踪立刻可以看到研究人员利用我们的方法，以确保在他们的实验中可复制性和准确性。考虑到广泛使用斑马鱼作为模式生物进行行为神经科学，这种方法会提高效率和实用性于未来的药理研究。

在本范例中，重复给药方案被采用，大约有反映人类饮用的时间表。鱼被随机分成3组:对照组，每天中度或每周-狂欢。给药方案是在持续21天，选择，因为它显著在以前的研究中超过⁷曝光时间。控制鱼获得零ALCOHOL，每天中度鱼获得0.2％的酒精每天一次，以及每周 - 狂欢的鱼，每周收到1.4％的酒精一次。亮/暗任务，使用后第2天停药的评估焦虑。这是一个相对简单的测试来管理其使用的矩形舞台，其中在一侧的壁是白色并且在另一侧是暗^9。成年斑马鱼更喜欢稳健的控制条件^6,9,13下舞台的黑暗的一面。增加焦虑操作性定义为显著更多的时间在黑暗中度过区，降低焦虑可以当鱼花比较多的时间在光区花假设。随着运动追踪软件，其他的信息变量也可以量化，包括平均速度，不动，蜿蜒和过渡区的^14。

在我们实验室开发的给药方法可以应用到其中的水溶性化合物被施用到一个或多个zebrafi任何研究SH。许多其他药剂可从该方法中受益，目前正在斑马鱼试验。常用的测试化合物包括尼古丁，利眠宁，丁螺环酮，和东莨菪碱，它们溶解在一种类似的方式，以乙醇;通过混合化学适量的水中。因此，该过程的一般范围更广，而不是仅限于乙醇。另外，用药物为多天的给药后，光/暗任务只有一个的许多行为测试，可以被采用。给药后或抽出时，可使用的其他流行的测定包括新颖槽潜水试验¹⁵和社会行为的测试，例如变浅^16。下面的过程将概述的重复传送的鱼或鱼个体的群体到含有目标化合物的药理学方案的有效方法。此外，测试焦虑与光照/黑暗试验过程在鱼谁在戒断暴露于醇施用长时间表后组进行说明。

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研究方案

所有的程序和行为测试正在协议号12年6月11日，这是符合加拿大理事会的管理和使用实验动物的动物护理的指导方针批准MacEwan大学的动物研究伦理委员会。

1.准备配料罐，解决方案和管理计划

1. 得到给药时间表，使得给予动物在相同的环境，并在一天的同一时间，以避免时间或偏压任何的困惑视觉刺激。
2. 获得尽可能多的相同的，1.5L的，清晰的聚丙烯产卵所必需的组尺寸的数量的坦克。使用基团的每罐8鱼，其允许2组鱼的要每天稍后在过程中进行测试（参见步骤3）。使用1保持槽和每组一个配料罐（组2×总数）。
   1. 将400微米产卵插入所有保温水箱。 ˚F患病与生境的水或反渗透水在适当的温度坦克（斑马鱼，25-28°C），它与温度一致鱼通常安置在。
      注意:可以有一些药物和缓冲栖息地水的化学组分之间不希望的化学相互作用。在这种情况下，使用缓冲的最小或没有水族馆的盐用于药物给药反渗透水，以及用于对照组。
   2. 确保坦克处于中立的环境，以避免给药过程中调节鱼的外部视觉刺激。
3. 制备药液。混在产卵箱的药物与人居水适量。通过组合3毫升的高品位的乙醇（95％非变性乙醇）与1497毫升的水制备的0.2％的乙醇溶液。通过组合21毫升乙醇与1479毫升的水制备的1.4％的乙醇溶液。

2.组网鱼和EThanol行政程序

1. 从它们的栖息地仔细坦克净鱼转移到含有产卵插入适当的储存罐。理想的情况是，房子在插入产卵鱼，以消除扣除干脆。
2. 所有的鱼在各自的储水槽，轻轻抬起产卵插入了贮水箱，并将其放入相应的药液罐（ 图1A）。
   1. 根据需要记录的给药时间。用30分钟，在此处描述的过程的乙醇溶液。
   2. 如果可能的话，有助理协助各实验组的传输同步进行的药液，以确保精确的计量时间。另外，转移一组的时间和跟踪个别群体的计量时间（ 图1A）。
3. 在必要的给药期结束时，从乙醇溶液小心地提起产卵刀片去掉鱼出的药液，并把轻轻回贮水箱。
4. 轻轻地网鱼在暂养箱，把它们放回它们的栖息地，直到下一个预定的时间给药，或将产卵插回储存罐，消除网。
5. 作为动物壳体设备，房屋，用作贮水箱在同一水箱和产卵插入动物的参数范围内以前，如果可能的提及。这将消除管理过程中完全扣除。

3.行为测试

1. 55厘米长9.5厘米深的有白色防水地板（ 图1B）获得光/暗的舞台宽9.5厘米。贴上白色和黑色防水不反光的纸张使用魔术贴竞技场的内壁，其中一半盖在白色的半盖在黑色的舞台上。填写竞技场5厘米的栖息地水的深度在25-28℃的温度。 MAINT艾因在整个测试这个温度。
2. 通过构造一个白色的三面外壳为竞技场可以位于Minimalize外部视觉刺激。确保在测试区域具有扩散顶灯灯光不会导致在水面上的反射，但是足够亮的运动跟踪软件，或交-hoc手册量化从视频图像。
3. 将舞台上的外壳，并设置行为跟踪软件的记录和运动分析参数。将测试时间为5-15分钟，这取决于所研究的问题。
   注意:在这里，我们用了5分钟。
4. 运输组鱼进行测试，以研究区的生境坦克，并放置在舞台上外壳的外面。适应的鱼10分钟。
5. 轻轻净一个从在光/暗竞技场的中心相应的组和地方鱼，一定要松开鱼，当它被定位成平行于所述舞台的长轴AVOID偏置鱼光或暗区。
6. 开始的动物被释放后立即记录的行为。观看任何软件问题跟踪鱼或鱼跳跃或冻结。旋转舞台上的180°后一半的受试者进行了测试，以防止任何的困惑，由于导致从竞技场的一端朝向机箱的开口端的偏见。
7. 经过庭审已经结束了，轻轻地网，从舞台上拆下来的鱼保持罐或栖息地的坦克。

4.分析

1. 检查时间花在光与暗区。对于每个组，每个鱼，得到在光与暗区所花费的相对时间，并使用一个样本t检验进行分析（;从总试验时间（分）150秒差或Wilcoxon符号秩检验对非参数数据）的以确定群体显著喜欢一个区域比其他。
2. 为了比较偏好，计算prefe减去花费在从在黑暗区中花费的时间的光带和比较各组之间的差异的时间伦斯索引。 叔测试可以用来比较两个组。比较多组同方差的利用Tukey的HSD post hoc检验的单向分析在必要时（或Kruskal-Wallis检验与唐恩的多重比较事后检验用于非参数数据）。
3. 比较速度，区转换，曲折的数目，以及各组不动。使用方差利用Tukey的HSD post hoc检验单向分析在必要时（或Kruskal-Wallis检验与唐恩的多重比较事后检验用于非参数数据）。

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结果

为了保持精度和控制在药理研究与斑马鱼是很重要的时候乙醇给药的持续时间一致和准确，如上所述。我们的过程可以增加给药过程的便利性和吞吐量。对任一每周-狂欢或每日中度时间表乙醇的给药导致改变的焦虑程度，与光照/黑暗试验测定，与对照组相比。当最后一次给药后两天测试，斑马鱼，对照组（谁没有收到任何酒精，但还是被转移到配料罐）中显示的行为预期的模式，与对照鱼的消?...

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讨论

涉及药品监督管理局在斑马鱼以往的研究仅仅依靠扣除鱼从家里罐运送他们向药液^12,16。网并不总是一致的，往往需要较长的时间比由于斑马鱼，其具有显著个体差异的逃避反应预期。传统的转印方法虽然有用，但也能够在通过减少总时间的鱼花的水以外的量，以及减少在动物之间的传输时间的变化量的改善。除了提高实用性，该方法为研究人员剂量大组鱼的同时在对于时间的精确量的解...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.