Новый метод введения препарата в несколько данио рерио (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) И количественное определение изъятия

Резюме

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Аннотация

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Введение

Данио (Danio rerio) является небольшой видов костистых рыб, происходящих в Индии, что является полезной моделью организм для поведенческого ¹ и медицинского исследовательского ^2,3. Данио рерио, также широко используется в тестировании различных фармакологических веществ для того, чтобы охарактеризовать их влияние на поведение. Различные дозы и схемы применения препарата были использованы для исследования поведения рыбок данио после введения соединений, таких как стимуляторы ^4, транквилизаторов ⁵ и этанола ^6-8.

Наша лаборатория исследовала эффекты различных графиков введения этанола на данио тревоги и передвижения в хорошо проверенных света / темно анализа ^{9, 20,} также как правило, называют в scototaxic анализа. Новый способ введения этанола была разработана с целью повышения эффективности для повторяющихся, ежедневного приема в течение длительного периода времени (21 дней) ⁶ . Ранее используемые методы были практичны, однако, мы стремились разработать метод, который снижается сетки, связанные с ним затраты времени, и позволило одновременно, точно приуроченный введения препарата интереса к большому количеству рыбы. В традиционной исследовательской использованием этанола, данио которые сетчатой ​​и переносили из одной емкости в другую, содержащий соответствующую смесь этанола и воды ^10-12. Хотя этот метод является широко принятым, сетки данио может увеличить изменчивость в времени, необходимого для внедрения и снять рыбу с лекарственным раствором. Таким образом, точное выдерживание в соединение, представляющее интерес, может изменяться в ходе эксперимента с участием повторные дозировки. Метод, который уменьшает источники ошибок, вытекающих из изменчивости в транспортных раза, таким образом, желательно. С нашим методом мы можем двигаться всю рыбу одновременно, в результате чего одинаковым временем дозирования в каждой рыбы. После этанола экспозиции (описано здесь), данио могут быть проверены в любое количесR поведенческих тестах, в том числе те, что оценки тревожности. Дозирование группы рыб, используя новый метод имеет практическое применение за пределами способности точно повторить и стандартизации дозирование между субъектами и между группами рыб. Появление нового программного обеспечения, что позволяет для отслеживания множественных рыбы сразу может увидеть исследователи используют наши методы, чтобы обеспечить воспроизводимость и точность в своих экспериментах. Учитывая широкое использование данио как модельного организма для поведенческой неврологии, этот метод позволит повысить эффективность и практичность в будущих фармакологических исследований.

В настоящее парадигмы, повторил дозирования график был использован, что примерно зеркал графиков человека питьевой. Рыба были рандомизированы в одну из трех групп: управления, ежедневно умеренной, или еженедельно, выпивка. Режим дозирования составляет 21 дней в срок, выбран потому, что он значительно превысил время экспозиции в предыдущих исследованиях ^7. Рыба управления получил нулевую Alcoпраздники, ежедневно умеренной рыба получила 0,2% алкоголя один раз в день, и раз в неделю-выпивка рыба получила сразу 1,4% алкоголя в неделю. Светлый / темный задача была использована для оценки тревоги после 2 дней выводе. Это относительно простой тест, чтобы управлять, который использует прямоугольную арену, в котором стены, с одной стороны белые, а с другой стороны ^{темно-9.} Взрослый данио решительно предпочитают темную сторону арены в условиях ^6,9,13 контроля. Увеличение беспокойство оперативно определяется как значительно больше времени, проведенного в темную зону, и снижение тревожности можно предположить, когда рыба проводит сравнительно больше времени, проведенного в световой зоны. С движением отслеживания программного обеспечения, другие информативные переменные также могут быть количественно, в том числе средней скорости, неподвижности, извилистые, и переводе зоны ^14.

Способ дозирования разработаны в нашей лаборатории может применяться к любому исследований, в которых водорастворимые соединения вводят в один или несколько zebrafiш. Многие другие фармакологические средства, которые могут извлечь выгоду из этой методологии в настоящее время проходит испытания в данио. Обычно тестируемые соединения включают никотин, хлордиазепоксид, буспирон и скополамин, который растворяют в аналогичным описанному в этаноле; смешиванием соответствующего количества химического вещества в воде. Таким образом, общая сфера этой процедуры гораздо шире и не ограничивается этанола. Кроме того, после приема препаратов для нескольких дней, свет / темнота задачей является лишь одним из многих поведенческих тестов, которые могли бы быть использованы. После введения препарата или во время вывода, другие популярные анализы, которые могут быть использованы, включают испытание водолазный новым бака ¹⁵ и тесты социальном поведении, таких как мелел ^16. Следующая процедура будут изложены эффективный способ передачи неоднократно группы рыбы или отдельных рыб в растворах, содержащих фармакологический интерес соединения. Кроме того, процесс тестирования тревоги с свет / темнота тестав группах рыб, которые находятся в выводе после воздействия длительных графиков администрации алкоголя будет описана.

протокол

Все процедуры и поведенческие испытания были одобрены животных совета MacEwan университета этике исследований по протоколу числа 06-11-12, который в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам по уходу за животными для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовьте Дозирование Танки, решений и расписание администрирования

1. Подготовьте график администрирования, такие, что животные дозирования в той же среде, и в это же время суток, чтобы избежать каких-либо смешивает времени или смещения для зрительных стимулов.
2. Получить как много одинаковых, 1,5 л, четкие танки полипропилен нереста как необходимые для числа размеров группы. Используйте группы 8 рыбы в баке, что позволяет в течение 2 групп рыб, которые будут испытаны в день позже в процедуре (см шаг 3). Используйте один сборный резервуар и один дозирования бак на группу (2x общее количество групп).
   1. Поместите 400 мкм нереста вставок во всех холдинговых танков. Fболен танки с водой среды обитания или обратного осмоса при правильной температуре (в течение данио, 25-28 ° С), что согласуется с температурой рыбы, как правило, размещены на.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там может быть нежелательные химические взаимодействия между некоторыми наркотиками и химических компонентов буферном обитания воды. В этой ситуации, использовать обратного осмоса вода буферизованную с минимальными или вообще без соли аквариума для введения наркотиков, а также для контрольных групп.
   2. Убедитесь, что танки находятся в нейтральной среде, чтобы избежать кондиционирования рыбу на внешние зрительные раздражители во время дозирования.
3. Приготовьте раствор наркотиков. Смешайте необходимое количество препарата с водой среды обитания в нерестовых резервуаров. Подготовьте 0,2% -ным раствором этанола путем объединения 3 мл высококачественного этанола (95% неденатурированный этанол) с 1497 мл воды. Подготовьте 1,4% -ным раствором этанола путем объединения 21 мл этанола с 1479 мл воды.

2. Сетка Рыба и Ethanol Порядок Администрация

1. Тщательно чистая рыба из их среды обитания танков и передачи в соответствующий бак, содержащий нереста вставку. В идеале, дом рыбу в нерестовый вставки для устранения взаимных расчетах вообще.
2. При всем рыбы в своих холдинговых танков, осторожно поднимите нерест вставить из бак и поместите его в соответствующий бак раствора препарата (рис 1А).
   1. Запишите время дозирования в соответствии с требованиями. Используйте 30 мин в растворе этанола в процедуре, описанной здесь.
   2. Если это возможно, есть помощники помочь с передачей всех экспериментальных групп к решению наркотиков одновременно, чтобы обеспечить точное время дозирования. Кроме того, передача одну группу в то время, и отслеживать отдельные группы «дозировки раз (рис 1А).
3. В конце необходимой периода дозирования, удалить рыбу из раствора этанола, тщательно подъема нерестовое вставкуиз лекарственного раствора и осторожно поместив обратно в резервуар.
4. Аккуратно чистая рыба в холдинговых танков и не размещать их обратно в места их обитания до следующего запланированного времени дозирования, или разместить нерест вставить обратно в бак, чтобы устранить сетку.
5. Как упоминалось ранее, если это возможно в рамках параметров животного жилья оборудования, дома животных в одном танке и нереста вставки, которые используются в качестве резервуар. Это позволит избежать взаимных расчетах вообще во время процедуры администрирования.

3. Поведенческий тест

1. Получение свет / темнота арену широкий 9,5 см на 55 см в длину и 9,5 см глубиной с белым водонепроницаемым полом (Фиг.1В). Прикрепите белую и черную водонепроницаемый неотражающую бумагу для внутренних стен арены с помощью липучки, с половины арены, покрытой белым и наполовину покрыта черным. Заполните арену на глубину 5 см с водой среды обитания при температуре 25-28 ° С. Maintайн эту температуру на протяжении тестирования.
2. Сводится на минимум внешних визуальные стимулы путем построения белый трехсторонний корпус для арена будет расположена в. Убедитесь полигоном имеет диффузный верхнее освещение, что не вызывает отражения от поверхности воды, пока достаточно ярким для отслеживания программного обеспечения движения, или по почте -hoc руководство количественная из видеоизображений.
3. Поместите арену в корпусе и установите учета и анализа движения параметры отслеживания программного обеспечения поведение. Установите продолжительность пробного 5-15 мин, в зависимости от вопроса исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали 5 мин.
4. Транспорт группа рыб, которые будут проверены на научно-исследовательской сфере в баке обитания и поместить их пределами арены корпусе. Акклиматизировать рыбу в течение 10 мин.
5. Аккуратно чистая рыба из соответствующей группы и места в центре свет / темнота арене, будучи уверенным, чтобы выпустить рыбу, когда она расположена параллельно длинной оси арене, чтобы АвоID смещения рыбы к светлой или темной зоне.
6. Начните запись поведение сразу после животное выпустили. Следите за каких-либо проблем программного обеспечения и отслеживание рыбу или для прыжков рыбы или замораживания. Поворот на арене 180 °, после половины субъектов были протестированы, чтобы предотвратить любые смешивает в связи с предубеждениями в результате которой конец арене ориентировано на открытом конце корпуса.
7. После суда закончилось, мягко чистая и снять рыбу с арены в бак или бак обитания.

4. Анализ

1. Осмотрите время, проведенное в свете по сравнению с темными зонами. Для каждой группы и каждой рыбы, получить относительное время, затрачиваемое на светлых и темных зон и анализировать с помощью одного образца т -test (или Уилкоксона ранг тест для непараметрического данных; разница от (половины от общего времени пробного) 150 сек) чтобы определить, если группы значительно предпочитают одну область за другой.
2. Для сравнения предпочтения, вычислить prefeИндекс Renče путем вычитания время, проведенное в легкой зоне от времени, проведенного в темную зону и сравнить различия между группами. t-тесты могут быть использованы для сравнения двух групп. Сравните несколько групп с односторонним анализа дисперсии с использованием тест HSD постфактум Тьюки, где это необходимо (или Крускала-Уоллиса с множественной сравнению Данна постфактум тест для непараметрического данных).
3. Сравните скорость, количество зон переходов, извилистые, и неподвижность всей группы. Используйте один-дисперсионного анализа с использованием тест HSD постфактум Тьюки, где это необходимо (или Крускала-Уоллиса с множественной сравнению Данна постфактум тест для непараметрического данных).

Результаты

Чтобы поддерживать точность и контроль в фармакологических исследований с данио, важно времени продолжительность введения этанола последовательно и точно, как описано выше. Наша методика может повысить удобство и пропускную способность процедуре дозирования. Введение этанола на ка?...

Обсуждение

Предыдущие исследования, связанные с введения препарата у рыбок данио просто полагались на сетки рыбу перевозить их из дома бака в раствор препарата ^12,16. Сетка не всегда последователен и часто занимает больше времени, чем ожидалось из-за побега реакции данио, которая имеет значит...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.