Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Ea quantificação da Retirada

Resumo

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Resumo

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) é uma pequena espécie de teleósteos originárias da Índia que é um organismo modelo útil para ^um comportamental e médica ^2,3 pesquisa. Peixe-zebra também são vulgarmente usado nos testes de várias substâncias farmacológicas, a fim de caracterizar o seu impacto sobre o comportamento. Vários dosagens e horários de administração de medicamentos têm sido utilizados para investigar o comportamento do peixe-zebra, após a administração de compostos tais como estimulantes ^{4, 5} e ansiolíticos etanol ^6-8.

Nosso laboratório tem investigado os efeitos de diferentes horários de administração de etanol sobre a ansiedade de peixe-zebra e locomoção no claro / escuro de ensaio bem validado ^{9, 20,} também comumente referido como o ensaio scototaxic. Um novo método de administração de etanol foi desenvolvido para aumentar a eficiência de repetitivo, a administração diária ao longo de um longo período de tempo (21 dias) ⁶ . Métodos utilizados anteriormente eram práticos, no entanto, buscou-se desenvolver um método que reduz de compensação, com seus custos de tempo associados, e permitiu simultânea administração do fármaco de interesse para um grande número de peixes, precisamente cronometrado. Na pesquisa utilizando tradicional etanol, peixe-zebra são compensados ​​e transferido de um tanque para outro contendo a mistura apropriada de etanol e água ^10-12. Enquanto este método é amplamente aceite, a compensação de peixe-zebra pode aumentar a variabilidade no tempo necessário para introduzir e remover o peixe a partir da solução da droga. Portanto, a exposição exacto para o composto de interesse pode variar durante o curso de uma experiência que envolve a administração repetida. Um método que reduz as fontes de decorrentes da variabilidade nos tempos de transporte de erro é, portanto, desejável. Com o nosso método, somos capazes de mover todos os peixes ao mesmo tempo, resultando em um tempo de dosagem idêntica em cada peixe. Após a exposição ao etanol (descrito aqui), peixe-zebra pode ser testado em qualquer númer de ensaios comportamentais, incluindo aqueles que avaliam a ansiedade. Dosagem grupos de peixes usando o novo método tem usos práticos além da capacidade de reproduzir com exatidão e padronizar a dosagem entre sujeitos e entre grupos de peixes. O advento de um novo software que permite o rastreamento de peixes múltiplos de uma só vez pode ver os pesquisadores utilizam nossos métodos para garantir a replicabilidade e precisão em seus experimentos. Considerando-se a utilização generalizada de peixe-zebra como um organismo modelo para neurociência comportamental, este método vai aumentar a eficiência e viabilidade em futuros estudos farmacológicos.

No presente paradigma, um esquema de dosagem repetida foi empregado que aproximadamente espelha horários de consumo humano. Os peixes foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos: controle, diária moderada, ou semanal-compulsivos. O esquema de administração foi de 21 dias de duração, escolheu porque excedeu significativamente os tempos de exposição em estudos anteriores ^7. Peixes controle recebeu a zero alcohol, peixe diariamente moderada receberam 0,2% de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu 1,4% de álcool, uma vez por semana. A tarefa de luz / escuro foi usado para avaliar a ansiedade após 2 dias de abstinência. Este é um teste relativamente simples de administrar, que utiliza uma arena rectangular em que as paredes de um lado, são de cor branca e no outro lado são escuros ^9. Peixe-zebra adulto robustamente preferem o lado negro da arena em condições de controle ^6,9,13. O aumento da ansiedade é operacionalmente definido como significativamente mais tempo gasto na zona escura, e diminuiu a ansiedade pode ser assumida quando o peixe passa relativamente mais tempo gasto na zona de luz. Com o software de rastreamento de movimento, outras variáveis ​​informativos também podem ser quantificados, incluindo velocidade média, a imobilidade, serpenteando, e zona de transição ^14.

O método de dosagem desenvolvido no nosso laboratório pode aplicar-se a qualquer pesquisa em que os compostos solúveis em água são administrados a um ou mais zebrafish. Muitos outros agentes farmacológicos que podem beneficiar desta metodologia estão sendo testadas em peixes-zebra. Comumente os compostos testados incluem a nicotina, clordiazepóxido, buspirona, e escopolamina, que são dissolvidos de um modo semelhante ao etanol; misturando a quantidade apropriada do produto químico em água. Portanto, o escopo geral deste procedimento é muito mais ampla e não limitada ao etanol. Além disso, após a dosagem com medicamentos para vários dias, a tarefa de luz / escuro é apenas um dos muitos testes comportamentais que podem ser empregadas. Após a administração de drogas ou durante a abstinência, outros ensaios populares que podem ser utilizados incluem o teste de mergulho novo tanque de ¹⁵ e testes de comportamento social, tais como empolamento ^16. O procedimento a seguir irá delinear um método eficiente de repetidamente transferir grupos de peixes ou peixes individuais em soluções que contêm um composto farmacológico de interesse. Além disso, o processo de teste de ansiedade com o teste de luz / escuroem grupos de peixe que se encontram em retirada depois de ser exposto a longas listas da administração do álcool irá ser descrito.

Protocolo

Todos os procedimentos e testes comportamentais foram aprovadas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade MacEwan sob o protocolo número 06-11-12, que está em conformidade com o Conselho Canadense para as diretrizes do Animal Care para o cuidado e uso de animais de experimentação.

1. Prepare Tanques Dosagem, soluções e esquema de administração

1. Preparar um esquema de administração de tal modo que os animais são doseados no mesmo ambiente e durante o mesmo tempo do dia a fim de evitar quaisquer confunde de tempo ou de polarização a estímulos visuais.
2. Obter o maior número, 1,5 L, tanques de desova de polipropileno claras idênticos como necessárias para o número de tamanhos de grupo. Utilização grupos de 8 peixes por tanque, o que permite por 2 grupos de peixe a ser testado por dia mais tarde no procedimento (ver etapa 3). Use um tanque de retenção e um tanque de dosagem por grupo (2x número total de grupos).
   1. Coloque 400 mm em todas as inserções de desova tanques de retenção. Fmal os tanques com água habitat ou água de osmose reversa na temperatura correta (de peixe-zebra, 25-28 ° C), que é consistente com o peixe temperatura são normalmente alojados em.
      NOTA: Não pode haver interações químicas indesejadas entre algumas drogas e os componentes químicos da água habitat tamponada. Nesta situação, usar água de osmose reversa tamponada com sais de aquário mínimo ou nenhum para a administração da droga, bem como para os grupos de controle.
   2. Certifique-se de que os tanques estão em um ambiente neutro para evitar peixes condicionado a estímulos visuais externos durante a administração.
3. Preparar a solução de fármaco. Misturar a quantidade apropriada de água com a droga habitat nos tanques de desova. Preparar a solução de etanol a 0,2% por combinação de 3 ml de um etanol de alto grau (95% de etanol não desnaturado) com 1,497 ml de água. Preparar a solução de etanol a 1,4% por combinação de 21 mL de etanol com 1479 ml de água.

2. A compensação Peixes e Ethanol Procedimento Administração

1. Peixe cuidadosamente líquida de seus tanques de habitats e transferência para o tanque de retenção apropriado contendo a inserção de desova. Idealmente, abrigar o peixe na inserção de desova para eliminar compensação por completo.
2. Com todos os peixes em seus respectivos tanques de retenção, levante com cuidado a desova inserir fora do tanque de retenção e colocá-lo no tanque de solução droga apropriada (Figura 1A).
   1. Anote o tempo de dosagem, conforme necessário. Use 30 min em solução de etanol para o processo descrito aqui.
   2. Se possível, tenha assistentes ajudar com a transferência de todos os grupos experimentais para a solução da droga ao mesmo tempo para garantir o tempo de dosagem precisa. Em alternativa, transferir um grupo de cada vez e manter o controle de dosagem vezes (Figura 1A) 'grupos individuais.
3. No final do período de dosagem necessária, remover o peixe a partir da solução de etanol com cuidado levantando a inserção de desovapara fora da solução do fármaco e colocando suavemente de volta para o tanque de retenção.
4. Gentilmente net o peixe nos tanques de conservação e colocá-los de volta para seu habitat até a próxima vez a administração programada, ou coloque a desova inserir de volta para o tanque de retenção para eliminar compensação.
5. Como mencionado anteriormente, se possível, dentro dos parâmetros do equipamento de animais habitação, casa dos animais do mesmo tanque de desova e inserção que é utilizada como o tanque de retenção. Isto irá eliminar compensação completamente durante o processo de administração.

3. Teste Comportamental

1. Obter uma luz / escuro arena de 9,5 centímetros de largura por 55 cm de comprimento e 9,5 cm de profundidade com um piso impermeável branco (Figura 1B). Cole papel não-reflexiva impermeável branco e preto para as paredes internas da arena usando velcro, com metade da arena coberta de branco e metade coberto de preto. Encher a arena a uma profundidade de 5 cm de altura com água a uma temperatura de habitat de 25-28 ° C. Manutain esta temperatura durante todo o teste.
2. Minimalize estímulos visuais externos através da construção de um cerco de três lados branco para a arena para situar-se em. Certifique-se de área de testes tem difundir iluminação superior que não causa reflexos na superfície da água, mas é suficientemente brilhante para o software de rastreamento de movimento, ou pós quantificação manual do -hoc a partir de imagens de vídeo.
3. Coloque a arena no recinto e definir os parâmetros de gravação e análise de movimento do software de rastreamento de comportamento. Defina a duração de teste para 5-15 min, dependendo da questão de pesquisa.
   NOTA: Aqui, usamos 5 min.
4. Transportar o grupo de peixes a ser testado para a área de pesquisa no tanque de habitat e colocá-los do lado de fora do gabinete arena. Aclimatar o peixe por 10 min.
5. Gentilmente net um peixe do grupo e local apropriado no centro da luz / Arena escuro, tendo a certeza de soltar o peixe quando é posicionada paralela ao longo eixo da arena para avoID de influenciar os resultados do peixe para a luz ou zona escura.
6. Comece comportamento gravação imediatamente depois que o animal é liberado. Preste atenção para os problemas de software com acompanhamento de peixe ou de peixe que salta ou congelamento. Girar a arena 180 ° depois de metade dos sujeitos foram testados para prevenir quaisquer confunde devido a preconceitos resultantes da qual a extremidade da arena está orientado para a extremidade aberta do invólucro.
7. Após o julgamento terminou, gentilmente net e retire o peixe da arena para um tanque ou tanque de habitat.

4. Análise

1. Examine o tempo gasto na luz contra as zonas escuras. Para cada grupo e cada peixe, obter o tempo relativo gasto nas zonas claras e escuras e analisar usando um teste t uma amostra (ou teste de Wilcoxon para dados não paramétricos; diferença de (metade do tempo de julgamento total) 150 sec) para determinar se os grupos preferem significativamente uma área sobre a outra.
2. Para comparar preferências, calcular a prefeíndice de rence, subtraindo o tempo gasto na zona de luz a partir do tempo gasto na zona escura e comparar as diferenças entre grupos. t- testes pode ser utilizado para comparar dois grupos. Compare vários grupos com um one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário.
3. Compare a velocidade, número de transições de zona, sinuosos, e imobilidade entre os grupos. Use one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário.

Resultados

Para manter a precisão e controlo em estudos farmacológicos com peixe-zebra é importante para o tempo de duração da administração de etanol de forma consistente e com precisão, tal como descrito acima. O nosso procedimento pode aumentar o rendimento e a facilidade do procedimento de dosagem. A administração de etanol no horário ou uma compulsão semanal ou diária moderada resultou em níveis de ansiedade alterados, medidos com o teste de claro / escuro, em comparação aos controles. Quando testados dois dia...

Discussão

Estudos anteriores envolvendo a administração da droga no peixe-zebra simplesmente invocada compensação peixes para transportá-los a partir de seu tanque de casa para a solução de drogas ^12,16. Rede nem sempre é consistente e frequentemente leva mais tempo do que o esperado, devido à resposta de fuga do peixe-zebra, que tem variabilidade individual significativa. Métodos de transferência tradicionais, embora úteis, pode ser melhorado através da diminuição da quantidade de tempo total dos peixes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.