Un nuevo método de la Administración de Drogas a múltiple pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Y la cuantificación de Retiro

Resumen

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Resumen

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) es una pequeña especie de teleósteos originarios de la India, que es un organismo modelo útil para conductual ¹ y ^2,3 médicos de investigación. El pez cebra también se utilizan comúnmente en el ensayo de diversas sustancias farmacológicas con el fin de caracterizar su impacto en el comportamiento. Varias dosis y programas de administración de drogas se han utilizado para investigar el comportamiento del pez cebra después de la administración de compuestos tales como estimulantes, ansiolíticos ^{4 5} y etanol ^6-8.

Nuestro laboratorio ha investigado los efectos de los diferentes programas de administración de etanol sobre la ansiedad pez cebra y la locomoción en la luz / oscuridad ensayo bien validado ^{9, 20,} también se conoce comúnmente como el ensayo scototaxic. Un nuevo método de administración de etanol fue desarrollado para aumentar la eficiencia para la administración repetitiva, diariamente durante un largo período de tiempo (21 días) ⁶ . Métodos utilizados anteriormente eran prácticos, sin embargo, hemos tratado de desarrollar un método que reduce la compensación, con sus costos de tiempo asociados, y permite la administración simultánea, precisamente cronometrado de la droga de interés para un gran número de peces. En la investigación usando etanol tradicional, el pez cebra se anotó y se transfiere desde un tanque a otro que contiene la mezcla apropiada de etanol y agua ^10-12. Si bien este método es ampliamente aceptada, redes pez cebra puede aumentar la variabilidad en el tiempo necesario para introducir y eliminar el pescado de la solución de fármaco. Por lo tanto, la exposición exacta para el compuesto de interés puede variar en el transcurso de un experimento con dosificación repetida. Un método que reduce las fuentes de error generados por la variabilidad en los tiempos de transporte es por lo tanto deseable. Con nuestro método somos capaces de mover todos los peces de forma simultánea, lo que resulta en el tiempo de dosificación idéntica en cada pez. Después de la exposición de etanol (que se describe aquí), el pez cebra se puede probar en cualquier number de ensayos de comportamiento, entre ellos los que evalúan la ansiedad. Dosificación grupos de peces utilizando el nuevo método tiene usos prácticos más allá de la capacidad de replicar y estandarizar la dosificación entre sujetos y entre los grupos de peces con precisión. La llegada de un nuevo software que permite el seguimiento de los peces múltiple a la vez puede ver investigadores utilizan nuestros métodos para garantizar la replicabilidad y la precisión en sus experimentos. Teniendo en cuenta el amplio uso del pez cebra como organismo modelo para la neurociencia conductual, este método aumentará la eficiencia y la practicidad en el futuro los estudios farmacológicos.

En el actual paradigma, un programa de dosificación repetida fue empleado que refleja aproximadamente horarios beber humanos. Los peces fueron asignados aleatoriamente a uno de tres grupos: control, diario-moderada, o semanal-compulsivos. El horario de dosis fue de 21 días de duración, elegido porque superó significativamente los tiempos de exposición en estudios previos ^7. Peces de control recibió cero alcohol, pescado al día de moderada recibió 0,2% de alcohol una vez por día, y el pescado semanal-atracón recibió 1,4% de alcohol una vez por semana. La tarea de luz / oscuridad se utilizó para evaluar la ansiedad después de 2 días de abstinencia. Esta es una prueba relativamente simple de administrar que utiliza una arena rectangular en el que las paredes en un lado son de color blanco y en el otro lado son de color oscuro ^9. Pez cebra adulto robustamente prefieren el lado oscuro de la arena bajo condiciones de control ^6,9,13. El aumento de la ansiedad se define operacionalmente como significativamente más tiempo de permanencia en la zona oscura, y la disminución de la ansiedad se puede suponer cuando el pez pasa relativamente más tiempo de permanencia en la zona de luz. Con el software de seguimiento de movimiento, otras variables informativas también se pueden cuantificar, incluyendo velocidad media, la inmovilidad, meandros, y la zona de transiciones ^14.

El método de dosificación desarrollado en nuestro laboratorio puede aplicarse a cualquier investigación en el que los compuestos solubles en agua se administran a uno o más zebrafish. Muchos otros agentes farmacológicos que pueden beneficiarse de esta metodología en la actualidad se están probando en el pez cebra. Comúnmente compuestos ensayados incluyen la nicotina, clordiazepóxido, buspirona, y escopolamina, que se disolvió en una manera similar a etanol; mezclando la cantidad apropiada de la sustancia química en el agua. Por lo tanto, el alcance general de este procedimiento es mucho más amplio y no limitado a etanol. Además, después de la dosificación con fármacos para múltiples días, la tarea luz / oscuridad es sólo una de las muchas pruebas de comportamiento que podrían emplearse. Después de la administración de drogas o durante la retirada, otros ensayos populares que se pueden utilizar incluyen la prueba de buceo tanque de novela ¹⁵ y las pruebas de comportamiento social, tales como shoaling ^16. El siguiente procedimiento se esbozarán un método eficiente de transferir repetidamente grupos de peces o peces individuales en soluciones que contienen un compuesto farmacológico de interés. Además, el proceso de las pruebas de la ansiedad con la prueba de luz / oscuridaden grupos de peces que están en retirada después de ser expuesto a largos horarios de la administración de alcohol se describirá.

Protocolo

Todos los procedimientos y pruebas de comportamiento fueron aprobados por la Junta de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de MacEwan con el número de protocolo 11/06/12, que está en cumplimiento con el Consejo Canadiense para las directrices del Cuidado de Animales para el cuidado y uso de animales de experimentación.

1. Preparar tanques de dosificación, soluciones y Horario Administración

1. Preparar un programa de administración de tal manera que los animales se dosifican en el mismo entorno y durante la misma hora del día para evitar cualquier confunde de tiempo o de empuje a los estímulos visuales.
2. Obtener la mayor cantidad, 1,5 L, tanques de desove polipropileno claras idénticas como sea necesario para el número de tamaños de los grupos. Use grupos de 8 peces por tanque, lo que permite 2 grupos de peces a ensayar por día más tarde en el procedimiento (ver paso 3). Utilice un tanque de retención y un tanque de dosificación por grupo (2x número total de grupos).
   1. Coloque 400 micras inserciones de desove en todos los tanques de almacenamiento. Fenfermos los tanques con agua de hábitat o agua de ósmosis inversa a la temperatura correcta (para el pez cebra, 25-28 ° C) que sea consistente con los peces de temperatura son normalmente alojados en.
      NOTA: No puede haber interacciones químicas no deseadas entre algunos medicamentos y los componentes químicos del agua tamponada hábitat. En esta situación, utilizar agua de ósmosis inversa tamponada con sales mínimas o ninguna acuario para la administración de fármacos, así como para los grupos de control.
   2. Asegúrese de que los tanques se encuentran en un ambiente neutral para evitar el pescado acondicionado a los estímulos visuales externos durante la dosificación.
3. Preparar la solución de fármaco. Mezcle la cantidad apropiada de la droga con agua hábitat en los tanques de desove. Preparar la solución de etanol al 0,2% mediante la combinación de 3 ml de un etanol de alto grado (95% de etanol no desnaturalizado) con 1497 ml de agua. Preparar la solución de etanol al 1,4% mediante la combinación de 21 ml de etanol con 1479 ml de agua.

2. Compensación de Pesca y EtProcedimiento Administración Hanol

1. Pescado con cuidado neto de sus tanques de hábitat y la transferencia en el tanque de retención adecuado que contiene el inserto de desove. Lo ideal sería que albergar a los peces en el inserto de desove para eliminar la compensación total.
2. Con todos los peces en sus respectivos tanques de almacenamiento, levante suavemente el desove insertar fuera del tanque de retención y colocarlo en el depósito de solución de fármaco apropiada (Figura 1A).
   1. Registre el tiempo de dosificación según sea necesario. Utilice 30 min en la solución de etanol para el procedimiento descrito aquí.
   2. Si es posible, tener asistentes ayudan con la transferencia de todos los grupos experimentales para la solución de fármaco simultáneamente para garantizar el tiempo de dosificación precisa. Por otra parte, la transferencia de un grupo a la vez y hacer un seguimiento de la dosificación veces (Figura 1A) grupos individuales.
3. Al final del período de dosificación requerida, quitar el pescado de la solución de etanol levantando cuidadosamente el inserto de desovede la solución de fármaco y colocando suavemente de nuevo en el tanque de retención.
4. Suavemente neta a los peces en los tanques de almacenamiento y colocarlos de nuevo en su hábitat hasta la próxima vez que la dosificación programada, o coloque el desove insertar de nuevo en el tanque de retención para eliminar la compensación.
5. Como se mencionó anteriormente, si es posible dentro de los parámetros de equipo de alojamiento de los animales, la casa de los animales en el mismo tanque y el inserto de desove que se utiliza como el tanque de retención. Esto eliminará la compensación por completo durante el proceso de administración.

3. Pruebas de Comportamiento

1. Obtener una luz / arena oscuro 9,5 cm de ancho por 55 cm de largo y 9,5 cm de profundidad con un piso impermeable blanco (Figura 1B). Coloque papel no reflectante impermeable blanco y negro a las paredes interiores de la arena usando velcro, con la mitad de la arena cubierta en blanco y negro en medio cubierto. Llenar la arena hasta una profundidad de 5 cm con agua hábitat a una temperatura de 25-28 ° C. Maintain esta temperatura durante toda la prueba.
2. Minimalize estímulos visuales externas mediante la construcción de un recinto blanco de tres lados de la arena que se encuentra en. Asegúrese de que el área de pruebas tiene difusa iluminación cenital que no causa reflejos en la superficie del agua, sin embargo, es lo suficientemente brillante para el software de seguimiento de movimiento, o post cuantificación manual de -hoc a partir de imágenes de vídeo.
3. Coloque la arena en el recinto y configurar los parámetros de grabación y análisis de movimiento del software de seguimiento de la conducta. Establezca la duración del ensayo a 5-15 minutos, dependiendo de la pregunta de investigación.
   NOTA: En este caso, hemos utilizado 5 min.
4. Transportar el grupo de peces a ensayar para el área de investigación en el tanque de hábitat y colocarlos fuera del recinto de la arena. Aclimatar a los peces durante 10 minutos.
5. Un pez con cuidado neto del grupo y el lugar adecuado en el centro de la luz / arena oscura, asegurándose de liberar a los peces cuando se coloca paralela al eje largo de la arena para evIdentificación del sesgar el pescado a la luz o de la zona oscura.
6. Comience comportamiento a grabar inmediatamente después de soltar al animal. Esté atento a cualquier problema de software con el seguimiento de los peces o de peces saltando o congelación. Gire la arena 180 ° después de la mitad de los sujetos se ha probado para prevenir cualquier confunde debido a los sesgos resultantes de qué extremo de la arena está orientada hacia el extremo abierto de la caja.
7. Después de que el juicio ha terminado, suavemente red y eliminar el pescado de la arena a un tanque de almacenamiento o depósito de hábitat.

4. Análisis

1. Examine el tiempo dedicado a la luz frente a las zonas oscuras. Para cada grupo y cada uno de los peces, obtenga el tiempo relativo transcurrido en las zonas claras y oscuras y analizar el uso de una muestra de t-test (o prueba de Wilcoxon para datos no paramétricos; diferencia de (la mitad del tiempo total de prueba) 150 seg) para determinar si los grupos prefieren significativamente un área sobre el otro.
2. Para comparar las preferencias, calcular una prefeíndice rencia restando el tiempo pasado en la zona de luz desde el tiempo pasado en la zona oscura y comparar las diferencias entre grupos. pruebas t- se puede utilizar para comparar dos grupos. Comparación de varios grupos con un solo sentido el análisis de varianza utilizando el test post hoc de Tukey HSD cuando sea necesario (o prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn test post hoc de los datos no paramétricos).
3. Comparar la velocidad, número de transiciones de zona, serpenteantes, y la inmovilidad en todos los grupos. Utilice solo sentido el análisis de varianza utilizando el test post hoc de Tukey HSD cuando sea necesario (o prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn test post hoc de los datos no paramétricos).

Resultados

Para mantener la precisión y el control en estudios farmacológicos con el pez cebra es importante el tiempo de la duración de la administración de etanol consistentemente y con precisión como se describe anteriormente. Nuestro procedimiento puede aumentar la facilidad y el rendimiento del procedimiento de dosificación. La administración de etanol en la fecha prevista o bien un binge-semanal o diaria de moderada resultó en niveles alterados de ansiedad, medida con el / test oscuro luz, en comparación con los con...

Discusión

Estudios previos que implican la administración de fármacos en el pez cebra, simplemente se han basado en la compensación de pescado para transportarlos desde su tanque de casa en la solución de fármaco ^12,16. Compensación no siempre es consistente y, a menudo toma más tiempo de lo esperado debido a la respuesta de escape del pez cebra, que tiene importante variabilidad individual. Métodos de transferencia tradicionales, aunque útiles, pueden mejorarse por la disminución de la cantidad de tiempo tot...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.