Çoklu Zebra balığı için İlaç İdaresi Bir Roman Yöntemi (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Ve Çekilme Niceleme

Özet

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Özet

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio) davranışsal ¹ ve tıbbi araştırma ^2,3 için yararlı bir model organizmadır Hindistan'da menşeli küçük bir teleost türdür. Balığı, sık davranışı üzerindeki etkilerini karakterize etmek amacıyla, çeşitli farmakolojik maddeler test kullanılır. Çeşitli dozlarda ve ilaç programları gibi uyarıcılar ^4, anksiyolotikler ⁵ ve etanol ^6-8 gibi bileşiklerin uygulanmasından sonra zebrafish davranışlarını araştırmak için kullanılmıştır.

Bizim laboratuvar da yaygın scototaxic deneyi olarak adlandırılan iyi valide açık / koyu tahlil ^{9, 20,} zebrafish anksiyete ve lokomosyon etanol idarenin programları farklı etkilerini araştırmıştır. Etanol uygulama yeni bir yöntem uzun bir zaman periyodu (21 gün) üzerinde ⁶ tekrarlayan, günlük uygulama için verimliliğini artırmak için geliştirilmiştir kadar. Daha önce kullanılan yöntemler ancak, biz ilişkili zaman maliyetleri ile, örgü azaltılmış bir yöntem geliştirmek için çalıştı, ve balık çok sayıda ilgi ilacın eşzamanlı, tam zamanlı yönetimini izin, pratik. Geleneksel araştırma kullanılarak, etanol içindeki, zebra balığı halinde ve etanol ve su ^12/10 ve uygun bir karışım ihtiva eden başka bir tanka aktarılır. Bu yöntem yaygın olarak kabul iken, Zebra balığı örgü tanıtmak ve ilaç çözeltisinden balık kaldırmak için alınan zaman içinde değişkenlik artabilir. Bu nedenle, söz konusu bileşik için tam maruz tekrarlanan doz içeren bir deney boyunca değişebilir. Taşıma zamanlarda değişkenlik kaynaklanan hata kaynaklarını azaltan bir yöntem arzu edilir. Bizim yöntemi ile her balık özdeş dozlama süresi sonuçlanan, aynı anda tüm balık hareket edebiliyoruz. (Burada anlatıldığı gibi), etanol maruz kalmasını takiben, zebra balığı bir numbe test edilebilirkaygıyı ölçmek de dahil olmak üzere davranışsal deneyleri, r. Yeni yöntemi kullanarak balık grupları dozaj doğru çoğaltmak ve balık grupları konular arasında ve genelinde dozlama standardize etmek yeteneği ötesinde pratik kullanımları vardır. Araştırmacılar kendi deneylerde tekrarlanabilirliği ve doğruluğunu sağlamak için yöntemler kullanabilir görebilirsiniz seferde birden fazla balık takibi için izin verir, yeni yazılım gelişi. Davranışsal sinirbilim için bir model organizma olarak zebrafish yaygın kullanımı göz önüne alındığında, bu yöntem gelecekte farmakolojik çalışmalarda verimlilik ve pratiklik artacak.

Mevcut paradigmada, tekrarlanan doz çizelgesi yaklaşık insan içme programları yansıttığının istihdam edildi. Kontrolü, günlük-orta, ya da haftalık-alem: Balık rastgele bir üç gruba ayrıldı. Dozlama çizelgesi önemli ölçüde önceki çalışmalarda ⁷ pozlama süreleri aşması nedeniyle seçilmiş, süresi 21 gün idi. Kontrol balık sıfır Alco aldıhol, günlük-orta balık günde bir kez% 0.2 alkol aldı ve haftalık-tıkınırcasına balık haftada% 1.4 alkol kez aldı. Açık / koyu bir görev geri çekilmesinden 2 gün sonra anksiyete değerlendirmek için kullanıldı. Bu bir tarafta duvar beyaz ve diğer tarafta ⁹ karanlık olan bir dikdörtgen arena kullanan yönetmek için basit bir testtir. Yetişkin Zebra balığı sağlam kontrol koşulları ^6,9,13 altında arena karanlık tarafını tercih ederim. Artan anksiyete operasyonel karanlık bölgede harcanan önemli ölçüde daha fazla zaman olarak tanımlanan ve balık ışık bölgesi harcanan nispeten daha fazla zaman harcıyor zaman anksiyete kabul edilebilir azalmıştır. Hareket-izleme yazılımı ile, diğer bilgilendirici değişkenler de ortalama hız, hareketsizlik, kıvrımlı dahildir, miktarı ve bölge ¹⁴ geçişler olabilir.

Laboratuvarda geliştirilen dozajlama metodu suda çözünür bileşikler, bir veya daha fazla zebrafi için tatbik edilen herhangi bir araştırma için geçerli olabilirsh. Bu metodoloji yararlanabilecek diğer birçok farmakolojik ajanlar da zebrabalıkları test ediliyor. Genel olarak test bileşikleri, etanol benzer bir şekilde içinde çözülür nikotin, klordiazepoksid, buspiron ve skopolamin, yer alır; su içine kimyasal uygun bir miktarda karıştırarak. Bu nedenle, bu işlemin genel kapsamı çok daha geniş ve etanol ile sınırlı değildir. Ayrıca, birden fazla gün boyunca ilaç verilmesinden sonra, açık / koyu bir görev kullanılabilirdi birçok davranış testleri sadece bir tanesidir. İlaç uygulamasından sonra veya çekilme sırasında, kullanılabilir diğer popüler deneyler yeni tankı dalış testi ¹⁵ ve ¹⁶ shoaling gibi sosyal davranış testlerini kapsamaktadır. Aşağıdaki prosedür tekrar tekrar ilgi farmakolojik bileşiği içeren çözümler balık ya da bireysel balık gruplarının nakledilmesi etkili bir yöntem açıklayacağım. Buna ek olarak, ışık / karanlık testi ile test anksiyete süreciAlkol tatbikat uzun programları maruz bırakıldıktan sonra geri çekme olan balık gruplar olarak tarif edilecektir.

Protokol

Tüm prosedürler ve davranışsal test bakımı ve deney hayvanlarının kullanımı için Hayvan Bakım kurallarına için Kanadalı Konseyi ile uyumlu olduğunu protokol numarası 06-11-12 altında MacEwan Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Doz Tankları, Çözümler ve Yönetim takvimi hazırlayın

1. Hayvanlar aynı ortamda ve görsel uyaranlara zaman ya da itme düzeneğinin herhangi bir boşa önlemek için günün aynı süre içinde dozlanır şekilde bir uygulama program hazırlanması.
2. Grup boyutları sayısı için gerektiği kadar özdeş, 1.5 L, şeffaf polipropilen yumurtlama tankları edinin. Balık 2 grup sağlar tank başına 8 balık, kullanımı grupları prosedürü daha sonra günde test edilmesi (basamak 3). Bir tutma tankı ve grup başına bir dozlama tankı (grup 2x toplam sayısı) kullanın.
   1. Tüm tanklarında 400 mikron yumurtlama yerlefltirmede. Fhasta yaşam su veya doğru sıcaklıkta osmoz su ters ile tankları (Zebra balığı için, 25-28 ° C) sıcaklık balık ile tutarlı normalde yer alırlar.
      Not: bazı ilaçların ve tamponlanmış yaşam suyun kimyasal bileşenleri arasında istenmeyen kimyasal etkileşimler olabilir. Bu durumda, ters ilaç verilmesi için en az bir ya da akvaryum tuzları ile tamponlanmış ozmoz su, yanı sıra kontrol gruplar kullanılır.
   2. Tanklar dozlama sırasında dış görsel uyaranlara klima balık önlemek için nötr ortamda olduğunuzdan emin olun.
3. İlaç çözeltisi hazırlayın. Yumurtlama tanklarda yaşam su ile ilacın uygun miktarda karıştırın. Su 1497 ml olan yüksek seviyede dereceli etanol (% 95 denatüre edilmiş etanol) 3 ml birleştirerek% 0.2 etanol çözeltisi hazırlayın. Su 1479 ml etanol ve 21 ml birleştirerek% 1.4 etanol çözeltisi hazırlayın.

2. netleştirilmesine Balık ve Et-metanol Yönetimi Prosedürü

1. Dikkatle net habitat tanklardan balık ve yumurtlama parçayı içeren uygun tutma tankına transferi. İdeal olarak, tamamen örgü ortadan kaldırmak için yumurtlama ekine balık ev.
2. Kendi tutma tanklardaki tüm balık, hafifçe yumurtlama tankından dışarı yerleştirin ve uygun ilaç solüsyon tankı (Şekil 1A) içine yerleştirin kaldırın.
   1. Gerektiği gibi dozaj zamanını kaydedin. Burada tarif edilen prosedüre için etanol çözeltisi içinde 30 dakika kullanın.
   2. Mümkünse, asistanlar hassas dozlama süresi sağlamak için aynı anda ilaç çözüm tüm deney gruplarının transferi ile yardım var. Alternatif olarak, bir seferde bir grup transferi ve bireysel grupların dozaj kez (Şekil 1A) izlemenize.
3. Gerekli dozaj lama dönemi sonunda, dikkatli bir şekilde yumurtlama inserti kaldırarak etanol çözeltisinden balık kaldırmailaç solüsyonu ve nazikçe geri tutma tankına yerleştirerek dışarı.
4. Tutma tankları balık ve sonraki zamanlanmış dozlama süresi kadar geri onların yaşam alanlarına yerleştirmek, ya da yumurtlama filelere ortadan kaldırmak için geri tutma tankına eklemek yerleştirin yavaşça net.
5. Hayvan barınma ekipman, ev tutma tankı olarak kullanılan aynı tankı ve yumurtlama astar içinde hayvanlar parametreleri içinde, daha önce, mümkünse de belirtildiği gibi. Bu uygulama prosedürü sırasında tamamen filelere ortadan kaldıracaktır.

3. Hareket Testleri

1. Uzun 55 cm ve beyaz bir su geçirmez kat (Şekil 1B) ile derin 9.5 cm 9.5 cm genişliğinde bir aydınlık / karanlık arena edinin. Arenada beyaz kaplı ve yarı siyah kaplı yarısı, cırt kullanarak arena iç duvarları beyaz ve siyah su geçirmez yansıtıcı olmayan kağıt yapıştırmayın. 25-28 ° C arasındaki bir sıcaklıkta yaşam su ile 5 cm derinliğe kadar arena doldurun. BakımTest boyunca bu sıcaklık değilim.
2. Arena içinde yer alan için bir beyaz üç-taraflı muhafaza oluşturarak dış görsel uyaranlara minimalize. Test alanı su yüzeyinde yansımaları neden olmaz üstten ışıklandırma yaygın olan, henüz yeterince hareket izleme yazılımı, ya da yazı için parlak olduğundan emin olun video görüntüleri -hoc manuel sayısallaştırma.
3. Muhafazaya arena yerleştirin ve davranış izleme yazılımı kayıt ve hareket analiz parametrelerini ayarlamak. Araştırma sorusu bağlı olarak, 5-15 dakika için deneme süresini ayarlayın.
   NOT: Burada, biz 5 dakika kullanılır.
4. Balık grup yaşam tankında araştırma alanına test edilecek ulaşım ve arena muhafazanın dışında koyun. 10 dakika süre ile balık alıştırıldı.
5. Açık / koyu arena merkezinde uygun grup ve yerden yavaşça net bir balık, bu Avo için arena uzun eksenine paralel olduğunda balık açıklaması için emin olmakışık veya karanlık bölgeye balık kutuplama kimliği.
6. Hayvan yayımlandıktan hemen sonra kayıt davranışı başlar. Balık izleme veya balık atlama veya dondurulması için herhangi bir yazılım sorunları için izleyin. Konuların yarısı nedeniyle arena sonu muhafazanın açık ucuna doğru yönlendirilmiş olan kaynaklanan önyargıları herhangi boşa önlemek için test edildikten sonra, Arena 180 ° döndürün.
7. Deneme, hafifçe net sona erdi ve bir tanktan ya da yaşam tankına arenada balık çıkarın sonra.

4. Analiz

1. Karanlık bölgelerde ışığa karşı harcanan zamanı inceleyin. Her yaş grubu ve her balık için, ışık ve karanlık bölgelerinde harcanan göreli bir zaman alması ve bir örnek t-testi kullanılarak analiz (veya Wilcoxon parametrik veriler için rank testi imzalı; fark, toplam deneme süresinin (yarım) 150 sn den) gruplar arasında anlamlı diğeri üzerinde bir bölgesini tercih olmadığını belirlemek için.
2. Bir prefe hesaplamak, tercihlerini karşılaştırmak içinkaranlık bölgede harcanan zaman ışık bölgesinde geçirdi ve gruplar arasındaki farklılıkları karşılaştırmak zaman çıkarılarak rekürensinden indeksi. t testleri iki grup karşılaştırmak için kullanılabilir. Tukey HSD post hoc testi kullanılarak varyans tek yönlü analizi ile birden fazla grubu karşılaştırmak gerektiğinde (Dunn çoklu karşılaştırma parametrik olmayan veriler için post hoc testi ile ya da Kruskal-Wallis testi).
3. Gruplar arasında hız, kıvrımlı bölge geçişler, sayısı ve hareketsizlik karşılaştırın. Tukey HSD post hoc testi kullanılarak varyansın tek-yönlü analizi kullanın gerektiğinde (Dunn çoklu karşılaştırma parametrik olmayan veriler için post hoc testi ile ya da Kruskal-Wallis testi).

Sonuçlar

Yukarıda tarif edildiği gibi sürekli olarak ve doğru bir zaman etanol tatbikat süresi önemlidir zebrabalıkları farmakolojik çalışmalarda doğruluk ve kontrolü sağlamak için. Bizim prosedür dozlama prosedürünün kolaylığı ve verimi artırabilir. Haftalık-aşırı ya da günlük orta derecede ya da zamanlama etanol yönetim kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, aydınlık / karanlık testi ile ölçülen değiştirilmiş anksiyete, sonuçlandı. Iki gün son dozdan sonra test edildiğinde, (...

Tartışmalar

Zebra balığı ilaç verilmesini içeren önceki çalışmalarda sadece ilaç solüsyonu ^12,16 içine kendi tankından onları taşımak için balık filelere dayanmıştır. Netleştirme her zaman tutarlı değildir ve genellikle nedeniyle önemli bireysel değişkenlik zebrabalıkları, bir kaçış tepkisi beklenenden daha uzun sürer. Geleneksel transfer yöntemleri, yararlı ise de, balık, su dışında geçirmek toplam süreyi azaltarak, hem de hayvanlar arasındaki aktarım süresi değişkenlik mikt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.