Un nuovo metodo di Drug Administration per multipli Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) E la quantificazione di Recesso

Riepilogo

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Abstract

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introduzione

Il pesce zebra (Danio rerio) è una piccola specie di teleostei originario dell'India che è un organismo modello utile per comportamentale ¹ e Medical Research ^2,3. Zebrafish sono anche comunemente usato nella sperimentazione di varie sostanze farmacologiche per caratterizzare il loro impatto sul comportamento. Vari dosaggi e orari di somministrazione dei farmaci sono stati utilizzati per studiare il comportamento del pesce zebra dopo la somministrazione di composti come stimolanti ^4, ansiolitici ⁵ e etanolo ^6-8.

Il nostro laboratorio ha studiato gli effetti dei diversi orari di somministrazione di etanolo su ansia zebrafish e locomozione in chiaro / scuro ben validato test ^{9, 20,} anche comunemente indicato come il test scototaxic. Un nuovo metodo di somministrazione di etanolo è stata sviluppata per aumentare l'efficienza di ripetitivo, somministrazione giornaliera per un lungo periodo di tempo (21 giorni) ⁶ . Metodi utilizzati in precedenza erano pratici, tuttavia, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che ha ridotto rete, con i suoi costi di tempo connessi, e ha permesso simultanea, la somministrazione a tempo proprio del farmaco di interesse per un gran numero di pesci. Nella ricerca utilizzando tradizionali etanolo, zebrafish vengono compensate e trasferito da un serbatoio all'altro contenente la miscela appropriata di etanolo ed acqua ^10-12. Anche se questo metodo è ampiamente accettato, compensazione zebrafish può aumentare la variabilità del tempo necessario per introdurre e togliere il pesce dalla soluzione della droga. Pertanto, l'esatta esposizione al composto di interesse può variare nel corso di un esperimento che coinvolge somministrazione ripetuta. Un metodo che riduce le fonti di errore derivante dalla variabilità dei tempi di trasporto è quindi desiderabile. Con il nostro metodo siamo in grado di spostare tutti i pesci simultaneamente, con conseguente tempo di dosaggio identico in ogni pesce. Dopo l'esposizione di etanolo (qui descritto), zebrafish può essere verificato in qualsiasi number di test comportamentali, compresi quelli che valutano l'ansia. Gruppi di pesci dosaggio utilizzando il nuovo metodo ha applicazioni pratiche al di là della capacità di replicare in modo accurato e standardizzare il dosaggio tra soggetti e tra gruppi di pesci. L'avvento di un nuovo software che consente la tracciabilità dei pesci multipli in una sola volta può vedere i ricercatori utilizzano i nostri metodi per garantire la replicabilità e la precisione nei loro esperimenti. Considerando l'uso diffuso di zebrafish come organismo modello per le neuroscienze comportamentali, questo metodo aumenta l'efficienza e praticità nei futuri studi farmacologici.

In questo paradigma, un programma di dosaggio ripetuto è stato impiegato che rispecchia circa orari bere umani. I pesci sono stati assegnati in modo casuale a uno dei tre gruppi: controllo, tutti i giorni-moderata, o settimanale-binge. Il programma di dosaggio è stato di 21 giorni di durata, scelto perché ha superato in modo significativo i tempi di esposizione in studi precedenti ^7. Pesci di controllo ha ricevuto lo zero alcohol, pesce tutti i giorni-moderata ha ricevuto 0,2% di alcol una volta al giorno, e pesce settimanale-binge ricevuto 1,4% di alcol una volta alla settimana. Il / compito buio la luce è stata utilizzata per valutare l'ansia dopo 2 giorni di astinenza. Questo è relativamente semplice test per amministrare che utilizza un'arena rettangolare, in cui le pareti da un lato sono bianchi e dall'altro lato sono scuri ^9. Zebrafish adulti preferiscono robusto il lato oscuro della scena in condizioni di controllo ^6,9,13. Aumento ansia è operativamente definita come molto più tempo trascorso nella zona di buio, e diminuita l'ansia può essere assunta quando il pesce spende relativamente più tempo trascorso nella zona di luce. Con il software motion-tracking, altre variabili informative possono essere quantificati, tra cui velocità media, l'immobilità, meandri, e la zona transizioni ^14.

Il metodo di dosaggio sviluppato nel nostro laboratorio può applicare a qualsiasi ricerca in cui i composti idrosolubili vengono somministrati una o più zebrafish. Molti altri agenti farmacologici che possono beneficiare di questa metodologia sono attualmente in fase di sperimentazione in zebrafish. Comunemente composti testati includono la nicotina, clordiazepossido, buspirone, e scopolamina, che vengono sciolti in un modo simile a etanolo; mescolando la quantità appropriata della sostanza chimica in acqua. Pertanto, la portata generale di questa procedura è molto più ampio e non limitato a etanolo. Inoltre, dopo la somministrazione di farmaci per più giorni, la luce / buio compito è soltanto uno dei molti test comportamentali che potrebbero essere impiegati. Dopo la somministrazione del farmaco o durante l'astinenza, altri saggi popolari che possono essere utilizzati includono il test di immersione romanzo serbatoio ¹⁵ e le prove di comportamento sociale, come shoaling ^16. La procedura che segue illustrerà un metodo efficiente di trasferire più volte gruppi di pesci o di singoli pesci in soluzioni contenenti un composto farmacologico di interesse. Inoltre, il processo di ansia test con la luce di prova / scuroin gruppi di pesci che sono in ritiro dopo essere stati esposti a lunghi orari di somministrazione alcole verrà descritto.

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Protocollo

Tutte le procedure e test comportamentali sono stati approvati da Research Animal Comitato Etico dell'Università di MacEwan con il numero di protocollo 06-11-12, che è in conformità con il Consiglio canadese per le linee guida di cura degli animali per la cura e l'uso di animali da esperimento.

1. Preparare dosaggio Serbatoi, soluzioni e schema di somministrazione

1. Preparare un programma di somministrazione tale che gli animali vengono dosati nello stesso ambiente e nello stesso momento della giornata per evitare confusioni di tempo o di polarizzazione a stimoli visivi.
2. Ottenere il maggior numero di identici, 1.5 L, chiare come serbatoi necessari per il numero di gruppi di dimensioni polipropilene di deposizione delle uova. Utilizzare i gruppi di 8 pesci per vasca, che permette per 2 gruppi di pesci da esaminare al giorno più avanti nella procedura (vedi punto 3). Utilizzare un serbatoio e un serbatoio di dosaggio per gruppo (2x numero totale di gruppi).
   1. Mettere 400 micron inserti di riproduzione in tutti i serbatoi. Fill i serbatoi con acqua habitat o ad osmosi inversa alla giusta temperatura (per zebrafish, 25-28 ° C), che è coerente con il pesce di temperatura sono normalmente alloggiati a.
      NOTA: Ci possono essere interazioni chimiche indesiderate tra alcuni farmaci e le componenti chimiche dell'acqua habitat tamponata. In questa situazione, utilizzare acqua ad osmosi inversa tamponata con sali minimi o nessun acquario per la somministrazione del farmaco, così come per i gruppi di controllo.
   2. Assicurarsi che i serbatoi sono in un ambiente neutrale per evitare di condizionamento pesce a stimoli visivi esterni durante il dosaggio.
3. Preparare la soluzione di droga. Mescolare la giusta quantità di farmaco con l'acqua habitat nelle vasche di riproduzione. Preparare la soluzione etanolica 0,2% combinando 3 ml di etanolo alto grado (95% etanolo non denaturato) con 1,497 ml di acqua. Preparare la soluzione etanolica 1,4% combinando 21 ml di etanolo con 1479 ml di acqua.

2. Rete di pesce e EtProcedura di Amministrazione hanol

1. Pesce con attenzione netti da loro carri armati di habitat e il trasferimento nel serbatoio appropriato contenente l'inserto di deposizione delle uova. Idealmente, ospitare il pesce nel foglietto deposizione delle uova per eliminare compensazione del tutto.
2. Con tutti i pesci nei loro rispettivi serbatoi di contenimento, sollevare delicatamente la deposizione delle uova inserire fuori dal serbatoio e posizionarlo nel serbatoio della soluzione farmacologica appropriata (Figura 1A).
   1. Registrare il tempo di dosaggio, come richiesto. Utilizzare 30 min in soluzione di etanolo per la procedura qui descritta.
   2. Se possibile, assistenti aiutano con il trasferimento di tutti i gruppi sperimentali alla soluzione farmaco simultaneamente per garantire un tempo preciso dosaggio. In alternativa, trasferire un gruppo alla volta e tenere traccia dei singoli gruppi di dosaggio volte (Figura 1A).
3. Alla fine del periodo di somministrazione prevista, togliere il pesce dalla soluzione di etanolo sollevando attentamente l'inserto riproduttivadalla soluzione droga e posizionando di nuovo nel serbatoio.
4. Delicatamente netto il pesce nelle di mantenimento e ricollocarle nel loro habitat fino alla prossima volta dosaggio programmato, o inserire inserire di nuovo nel serbatoio la deposizione delle uova per eliminare rete.
5. Come accennato in precedenza, se possibile entro i parametri delle apparecchiature di stabulazione degli animali, la casa degli animali nella stessa vasca e l'inserto di deposizione delle uova che viene utilizzato come serbatoio. In questo modo si elimina la compensazione del tutto durante la procedura di amministrazione.

3. Test comportamentale

1. Ottenere una luce / arena scuro larghezza 9,5 centimetri con 55 cm di lunghezza e 9,5 cm di profondità con un pavimento bianco impermeabile (Figura 1B). Fissare impermeabile carta non riflettente bianco e nero alle pareti interne della Arena utilizzando velcro, con la metà dell'arena coperta di bianco e per metà coperto di nero. Riempire la scena ad una profondità di 5 cm con acqua ambiente alla temperatura di 25-28 ° C. Maintain questa temperatura durante tutto il test.
2. Minimo lo stimoli visivi esterni con la costruzione di una recinzione bianca a tre lati per l'arena di essere situato in. Assicurarsi che l'area di prova è diffusa illuminazione ambientale che non provochi riflessi sulla superficie dell'acqua, ma è sufficientemente luminoso per il software di monitoraggio movimento, o per posta -hoc quantificazione manuale da immagini video.
3. Posizionare l'arena nel recinto e impostare i parametri di registrazione e di analisi del movimento del software di monitoraggio comportamento. Impostare la durata di prova per 5-15 minuti, a seconda della domanda di ricerca.
   NOTA: Qui, abbiamo usato 5 min.
4. Trasportare il gruppo di pesci da testare per l'area di ricerca nel serbatoio habitat e metterli al di fuori del recinto dell'arena. Acclimatare il pesce per 10 minuti.
5. Un pesce delicatamente netta del gruppo e il luogo appropriato nel centro della luce / arena scuro, avendo cura di rilasciare il pesce quando è posizionato parallelamente all'asse lungo dell'arena di Avoid polarizzazione il pesce per la luce o zona oscura.
6. Inizia comportamento registrazione immediatamente dopo che l'animale è stato rilasciato. Guarda per eventuali problemi di software con monitoraggio del pesce o per il salto di pesce o di congelamento. Ruotare l'arena di 180 ° dopo la metà dei soggetti sono stati testati per evitare che confonde a causa di pregiudizi derivanti dalla quale estremità dell'arena è orientata verso l'estremità aperta del contenitore.
7. Dopo il processo è terminato, delicatamente rete e togliere il pesce dal nell'arena per un serbatoio o serbatoio di habitat.

4. Analisi

1. Esaminare il tempo trascorso in luce rispetto a zone scure. Per ogni gruppo e ogni pesce, ottenere il relativo tempo trascorso in zone chiare e scure e analizzare utilizzando un t-test un campione (o di Wilcoxon per dati non parametrica; differenza (metà del tempo di prova totale) 150 sec) per determinare se i gruppi preferiscono significativamente una zona sopra l'altra.
2. Per confrontare le preferenze, calcolare un preferiscaIndice renza sottraendo il tempo trascorso nella zona di luce dal tempo trascorso nella zona di buio e confrontare le differenze tra i gruppi. t-test può essere utilizzato per confrontare due gruppi. Confronta più gruppi con una analisi a senso unico della varianza utilizzo di test HSD di Tukey post hoc dove (o test di Kruskal-Wallis con comparazione multipla di Dunn post hoc test per dati non parametrico) necessari.
3. Confrontare la velocità, il numero di transizioni di zona, serpeggianti, e l'immobilità tra i gruppi. Utilizzare una analisi della varianza utilizzando test di HSD post-hoc di Tukey dove (prova o Kruskal-Wallis con comparazione multipla di Dunn post hoc test per dati non parametrico) necessari.

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Risultati

Per mantenere la precisione e controllo in studi farmacologici con zebrafish è importante volta la durata della somministrazione di etanolo costantemente e accuratamente come descritto sopra. La procedura può aumentare la facilità e la velocità del procedimento di dosaggio. La somministrazione di etanolo nei tempi previsti sia un settimanale o giornaliera, binge-moderata ha determinato livelli di ansia alterati, misurati con la luce / buio di prova, rispetto ai controlli. Quando la prova due giorni dopo l'ultima...

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Discussione

Precedenti studi che coinvolgono la somministrazione del farmaco in zebrafish hanno semplicemente fatto affidamento sulla compensazione di pesce per il loro trasporto dal proprio serbatoio di casa nella soluzione della droga ^12,16. La compensazione non è sempre coerente e spesso richiede più tempo del previsto a causa della risposta di fuga del pesce zebra, che ha una significativa variabilità individuale. Metodi di trasferimento tradizionali, pur utile, possono essere migliorate riducendo la quantità di ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.