Une nouvelle méthode de Drug Administration à la sclérose en poisson zèbre (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Et la quantification de retrait

Résumé

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Résumé

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) est une petite espèce de poissons téléostéens originaires de l'Inde qui est un organisme modèle utile pour comportementale ¹ et ^2,3 médicale recherche. Le poisson zèbre sont aussi couramment utilisé dans l'essai de diverses substances pharmacologiques afin de caractériser leur impact sur le comportement. Diverses doses et schémas d'administration de médicaments ont été utilisés pour étudier le comportement du poisson zèbre après l'administration de composés tels que des stimulants, des anxiolytiques ⁴ et ⁵ de l'éthanol ^8/6.

Notre laboratoire a étudié les effets de différents schémas d'administration de l'éthanol sur l'anxiété poisson zèbre et de la locomotion à la lumière / obscurité essai bien validé ^{9, 20,} aussi communément appelé le test scototaxic. Un nouveau procédé d'administration de l'éthanol a été développé pour améliorer l'efficacité de répétition, l'administration quotidienne pendant une longue période de temps (21 jours) ⁶ . Méthodes précédemment utilisées étaient pratique, cependant, nous avons cherché à développer une méthode qui réduit filet, avec ses coûts de temps associées, et a permis simultanée, l'administration chronométré précisément de la drogue de l'intérêt pour un grand nombre de poissons. Dans la recherche utilisant de l'éthanol traditionnel, le poisson zèbre sont déduits et transféré d'un réservoir à un autre contenant le mélange approprié de l'éthanol et de l'eau ^10-12. Bien que cette méthode est largement acceptée, filets de poisson zèbre peut augmenter la variabilité dans le temps nécessaire pour introduire et retirer le poisson de la solution médicamenteuse. Par conséquent, l'exposition exacte du composé d'intérêt peut varier au cours d'une expérience impliquant des doses répétées. Une méthode qui permet de réduire les sources d'erreurs résultant de la variabilité des temps de transport est donc souhaitable. Avec notre méthode, nous sommes en mesure de déplacer tous les poissons en même temps, résultant en temps de dosage identique dans chaque poisson. Après l'exposition de l'éthanol (décrit ici), le poisson-zèbre peut être testé en number de tests comportementaux, y compris ceux qui évaluent l'anxiété. Dosage des groupes de poissons à l'aide de la nouvelle méthode a des applications pratiques au-delà de la capacité de se répliquer et de normaliser le dosage entre les sujets et entre les groupes de poissons avec précision. L'avènement d'un nouveau logiciel qui permet de faire le suivi de plusieurs poissons à la fois peut voir les chercheurs utilisent nos méthodes pour assurer la reproductibilité et la précision dans leurs expériences. Compte tenu de l'utilisation généralisée de poisson zèbre comme organisme modèle pour neurosciences comportementales, cette méthode permettra d'accroître l'efficacité et de praticité dans les futures études pharmacologiques.

Dans le paradigme actuel, un calendrier de dosage répété était employé qui reflète approximativement horaires de consommation humaine. Les poissons ont été assignés au hasard à l'un des trois groupes: contrôle, quotidien modéré, ou hebdomadaire frénésie. Le programme de dosage était de 21 jours dans la durée, choisi parce qu'il a dépassé de manière significative les temps d'exposition dans les études précédentes ^7. poissons de commande reçu alco zérohol, poisson quotidien modéré reçu 0,2% d'alcool une fois par jour, et le poisson hebdomadaire binge reçu 1,4% d'alcool une fois par semaine. La tâche clair / foncé a été utilisé pour évaluer l'anxiété après 2 jours de retrait. Ceci est un test relativement simple à administrer qui utilise une arène rectangulaire dans laquelle les parois d'un côté, sont de couleur blanche et de l'autre côté sont sombres ^9. Poisson zèbre adulte préfèrent robuste le côté sombre de la scène dans des conditions de contrôle ^6,9,13. Augmentation de l'anxiété est opérationnel correspond à beaucoup plus de temps passé dans la zone sombre et une diminution de l'anxiété peut supposer lorsque le poisson passe relativement plus de temps passé dans la zone de lumière. Avec le logiciel de suivi de mouvement, d'autres variables d'information peuvent également être quantifiés, y compris la vitesse moyenne, l'immobilité, sinueux, et les transitions zone ^14.

La méthode de dosage développé dans notre laboratoire peut appliquer à toute recherche dans lequel les composés solubles dans l'eau sont administrés une ou plusieurs zebrafish. Beaucoup d'autres agents pharmacologiques qui peuvent bénéficier de cette méthode sont actuellement testés chez le poisson zèbre. Généralement les composés testés sont la nicotine, le chlordiazépoxyde, la buspirone, et la scopolamine, que l'on dissout d'une manière similaire à l'éthanol; en mélangeant la quantité appropriée de la substance chimique dans l'eau. Par conséquent, la portée générale de cette procédure est beaucoup plus large et non limitée à l'éthanol. En outre, après l'administration de médicaments pour plusieurs jours, la tâche de lumière / obscurité est seulement un des nombreux tests comportementaux qui pourraient être employées. Après l'administration du médicament ou durant le retrait, d'autres tests populaires qui peuvent être utilisés comprennent le test de plongée roman de réservoir ¹⁵ et des tests de comportement social tels que shoaling ^16. La procédure suivante présente une méthode efficace de transfert à plusieurs reprises des groupes de poissons ou individuelle dans des solutions contenant un composé pharmacologique d'intérêt. En outre, le processus de test anxiété avec le test lumière / obscuritédans les groupes de poissons qui sont en retrait après avoir été exposés à de longues listes d'administration d'alcool sera décrit.

Protocole

Toutes les procédures et les tests comportementaux ont été approuvés par le Conseil d'éthique de la recherche animale de l'Université MacEwan sous le numéro de protocole 11/06/12, qui est en conformité avec le Conseil canadien pour les directives de protection des animaux pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparer Réservoirs de dosage, des solutions et le schéma d'administration

1. Préparer un calendrier d'administration tels que les animaux sont traités dans le même environnement et dans le même temps de la journée pour éviter les facteurs de confusion de temps ou de sollicitation à des stimuli visuels.
2. Obtenir le plus grand nombre, 1,5 L, réservoirs en polypropylène de frai claires identiques nécessaires pour le nombre de tailles de groupe. Utilisez les groupes de 8 poissons par bassin, ce qui permet pour 2 groupes de poissons à tester par jour plus tard dans la procédure (voir l'étape 3). Utiliser une cuve de retenue et une cuve de dosage par groupe (2x nombre total de groupes).
   1. Placez 400 um inserts de frai dans tous les bassins de rétention. Famal les réservoirs avec de l'eau ou de l'habitat eau par osmose inverse à la bonne température (pour le poisson-zèbre, 25-28 ° C) qui est compatible avec le poisson de température sont normalement logés à.
      REMARQUE: Il peut y avoir des interactions chimiques indésirables entre certains médicaments et les composants chimiques de l'eau de l'habitat tamponnée. Dans cette situation, utiliser de l'eau par osmose inverse tamponné avec des sels d'aquarium minimales ou pas pour l'administration du médicament, ainsi que pour les groupes de contrôle.
   2. Veiller à ce que les réservoirs sont dans un environnement neutre pour éviter de conditionnement du poisson à des stimuli visuels extérieurs pendant le dosage.
3. Préparer la solution de médicament. Mélanger la quantité appropriée de ce médicament avec de l'eau de l'habitat dans les bassins de ponte. Préparation de la solution d'éthanol à 0,2% en combinant 3 ml d'éthanol à une forte teneur (95% d'éthanol non dénaturé) avec 1497 ml d'eau. Préparation de la solution d'éthanol à 1,4% en combinant 21 ml d'éthanol avec 1 479 ml d'eau.

2. La compensation poisson et EtProcédure d'administration Hanol

1. Filet de pêche avec soin à partir de leurs réservoirs de l'habitat et le transfert dans le réservoir de retenue approprié contenant l'insert de frai. Idéalement, abritera le poisson dans l'insert de frai pour éliminer compensation tout à fait.
2. Avec tous les poissons dans leurs réservoirs de stockage respectifs, soulevez doucement le frai insérer sur le réservoir de stockage et le placer dans le réservoir de solution appropriée des médicaments (figure 1A).
   1. Noter le temps de dosage requis. Utiliser 30 min dans la solution d'éthanol à la procédure décrite ici.
   2. Si possible, les assistants aident au transfert de tous les groupes expérimentaux à la solution de médicament à la fois à assurer un temps de dosage précis. Sinon, transférer un groupe à la fois et de garder trace de dosage fois (figure 1A) de groupes individuels.
3. A la fin de la période de traitement nécessaire, retirer le poisson de la solution d'éthanol en soulevant soigneusement l'insert de fraide la solution de médicament et mettre doucement dans le réservoir de retenue.
4. Doucement net les poissons dans les réservoirs de rétention et remettez-les dans leur habitat jusqu'à la prochaine fois de dosage régulier, ou placer le frai insérer dans le réservoir de retenue pour éliminer filet.
5. Comme mentionné précédemment, si possible dans les paramètres de l'équipement de locaux d'élevage, les animaux de la maison même réservoir et insertion de reproduction qui est utilisé comme réservoir de stockage. Cela permettra d'éliminer complètement filets pendant la procédure d'administration.

3. tests comportementaux

1. Obtenir une lumière / obscurité arène 9,5 cm de large par 55 cm de long et 9,5 cm de profondeur avec un plancher imperméable blanc (figure 1B). Fixez papier non réfléchissant blanc et noir étanche sur les parois intérieures de la scène à l'aide du velcro, avec la moitié de l'arène couverte en blanc et à moitié recouvert de noir. Remplir l'arène à une profondeur de 5 cm avec de l'eau de l'habitat à une température de 25-28 ° C. Maintain cette température tout au long de l'essai.
2. Minimaliser stimuli visuels externes en construisant une enceinte à trois faces blanc pour l'arène pour être situé dans. Assurer la zone de test a diffuser un éclairage zénithal qui ne provoque pas de réflexions sur la surface de l'eau, mais est suffisamment lumineux pour le logiciel de suivi de mouvement, ou par la poste quantification -hoc manuel à partir d'images vidéo.
3. Placer l'arène dans l'enceinte et définir les enregistrement et d'analyse de mouvement paramètres du logiciel de suivi du comportement. Réglez la durée de l'essai de 5-15 min, en fonction de la question de recherche.
   NOTE: Ici, nous avons utilisé 5 min.
4. Transporter le groupe de poissons à tester à la zone de recherche dans le réservoir de l'habitat et de les placer à l'extérieur de l'enceinte de l'arène. Acclimater les poissons pendant 10 minutes.
5. Un poisson doucement net du groupe et endroit approprié dans le centre de la lumière / obscurité arène, en étant sûr de libérer le poisson quand il est positionné parallèlement à l'axe de l'arène pour avoid sollicitant le poisson à la lumière ou de la zone sombre.
6. Commencez comportement enregistrement immédiatement après que l'animal est relâché. Soyez attentif aux problèmes de logiciels avec le suivi du poisson ou pour le saut de poisson ou de gel. Tournez la scène à 180 ° après la moitié des sujets ont été testés pour éviter les facteurs de confusion en raison de biais résultant de quelle extrémité de l'arène est orientée vers l'extrémité ouverte de l'enceinte.
7. Après la fin du procès, doucement net et retirer le poisson de l'arène pour un réservoir de retenue ou réservoir de l'habitat.

4. Analyse

1. Examiner le temps passé à la lumière par rapport à des zones sombres. Pour chaque groupe et chaque poisson, obtenir le temps relatif passé dans les zones claires et sombres et d'analyser l'aide d'un t -test d'un échantillon (ou de Wilcoxon rank test pour les données non paramétrique; différence de (la moitié du temps d'essai totale) 150 sec) pour déterminer si les groupes préfèrent nettement une zone sur l'autre.
2. Pour comparer les préférences, calculer un instaindice rence en soustrayant le temps passé dans la zone la lumière du temps passé dans la zone sombre et comparer les différences entre les groupes. tests t peut être utilisé pour comparer deux groupes. Comparez plusieurs groupes avec une analyse unidirectionnelle de variance en utilisant le test HSD post hoc de Tukey le cas échéant (ou Kruskal-Wallis test avec comparaison multiple de Dunn de test post hoc des données non paramétrique).
3. Comparer la vitesse, le nombre de transitions de zone, sinueux, et l'immobilité entre les groupes. Utilisez une analyse de variance en utilisant le test HSD post hoc de Tukey le cas échéant (ou Kruskal-Wallis test avec comparaison multiple de Dunn de test post hoc des données non paramétrique).

Résultats

Pour assurer la précision et le contrôle dans le poisson zèbre avec les études pharmacologiques, il est important pour la durée du temps de l'administration d'éthanol uniforme et précise de la manière décrite ci-dessus. Notre procédé permet d'augmenter la facilité et le débit de la procédure de dosage. L'administration de l'éthanol soit toutes les semaines ou tous les jours binge-modérée horaire a donné lieu à des niveaux d'anxiété altérées, mesurées avec le / test sombre ...

Discussion

Des études antérieures portant sur ​​l'administration de médicaments chez le poisson zèbre ont simplement compté sur la compensation du poisson pour les transporter à partir de leur réservoir d'origine dans la solution médicamenteuse ^12,16. La compensation est pas toujours cohérente et prend souvent plus de temps que prévu en raison de la réaction de fuite du poisson zèbre, qui a la variabilité individuelle importante. Méthodes de transfert classiques, tout en étant utiles, peuvent ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.