收集，分离，和人类宫颈样品的流式细胞仪分析

摘要

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

摘要

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

引言

大多数新感染艾滋病毒引起全世界通过异性性接触传染，女性占新发感染的47％，2011年（联合国艾滋病规划署^1）。了解女性生殖道（FGT），主入口门户为HIV和其他性传染病原体之一，是的路径，寻找有效的策略，以防止感染的高度重视。在生殖器粘膜免疫应答是独特的清楚和从那些在外周血²测得不同。然而，在FGT免疫动力学的当前的知识是在最好的限定。迄今为止，黏膜免疫环境的研究主要集中在肠道相关淋巴组织（GALT），它已经很清楚，感染后粘膜组织中的早期事件，对后续的疾病进展^3,4的强烈冲击。从生殖器粘膜采集样本代表一个巨大的挑战，并至少部分负责LACk的FGT的免疫学的理解。解决在不同的环境，是FGT就必须有效的方法从该地区采集和分析样品的情况下主机和病原体之间的免疫动态的难题。

在FGT被分成两部分:上部生殖道，包括输卵管，子宫内膜和宫颈管，下部尿路含有宫颈和阴道（由Kaushic评论等 ^5）。现在还不清楚是什么，这些不同的网站的相对贡献是艾滋病毒感染，但据信，这两个网站可能导致艾滋病毒进入^6。 T细胞代表在上下生殖道的白细胞的40-50％，而巨噬细胞含有约10％（以罗德里格斯加西亚评论等 ^2）。 T细胞可以在阴道，子宫颈，子宫内膜和被检测到。巨噬细胞是更强烈的局部性ZED的子宫内膜和肌层结缔组织比子宫颈，虽然它们可以同时在组织中被检测到。最后，浆细胞样树突细胞（PDC）和朗格汉斯细胞也可以在FGT组织中检测到。表型和免疫人群及其易于感染艾滋病毒的比例可根据荷尔蒙周期变化重要的是，使用荷尔蒙避孕药，细菌性阴道炎，或性活动^5,7-9的。

多种方法已经被开发，研究免疫人群的FGT和环境。宫颈活检，宫颈cytobrushes和宫颈阴道灌洗液^{（CVL）10-12}是整个文献中最常用的。 CVL收集由PBS灌洗是最简单的方法，并允许免疫调节蛋白，但结果在极低的细胞产量的研究中，并因此不适合用于研究FGT ¹³的免疫细胞群。 CVL样品，另一方面，VERY用于通过测量用的方法，如ELISA，细胞因子微球阵列¹⁴或质谱^15,16的各种细胞因子，趋化因子或抗微生物因子的表达评估FGT的免疫环境是有用的。免疫细胞频率，表型和功能特性可通过宫颈细胞刷或宫颈活检取样采集子宫颈单个核细胞（CMC）来实现。

宫颈活检取样是一种侵入性方法，其增加出血的不适和风险，需要2至11天治愈以下的步骤取决于女人¹²的免疫状态。另一方面，宫颈cytobrushes，尽管收集的细胞的产量较低，是一种微创的，更方便的方法来收集免疫细胞从FGT。这两种方法都可以达到的CD45 +白细胞中相同的产率，但是两个连续的子cytobrushes是必要的，得到的细胞相同数量的载一n一个活检^13。然而，细胞刷取样仍然为进一步体外表型通过流式细胞仪¹⁴提供了细胞的可接受的数量（大约5,000的CD45 +细胞/细胞刷）。此外，功能特性，可以进行对这些样品，如刺激和细胞内流式细胞术定量PCR或已使用细胞刷衍生的CMC识别HIV特异性免疫应答¹⁷或Th细胞极化¹⁸执行。扩张性T细胞的人口也可方便与中医诊所¹⁹功能研究。

要注意的是活检和cytobrushes采样FGT不同的部分是很重要的。活检是从宫颈^12,13的上皮和基质的优越部导出，而颈cytobrushes采样宫颈内口，收集从宫颈管和推测的转化区的上皮来源的细胞。因此，细胞刷样品品尝重新只园组成的柱状上皮单层的，而活检，包括由鳞状复层上皮衬里⁵的区域。其结果是，通过宫颈活检和细胞刷收集的白细胞种群的性质不同而不同。活检收集CD3 + T细胞的比例较高，而cytobrushes导致收集的CD14 +单核细胞/巨噬细胞¹³的比例较高。

研究FGT的免疫学一直是关注了很多年^20-22，我们已经积累了大量的专业知识与细胞刷源性间中医诊所的研究。我们的研究重点主要在艾滋病病毒感染，感染和HIV阴性曝光（HESN）女性性工作者来自肯尼亚内罗毕的研究。优先病毒复制在活化的T细胞²³和较低的数字活化细胞，可以由艾滋病病毒在FGT有针对性有助于防止感染HIV。根据这一假设，几个STUDI线ES形容HESN性工作者谁是高度暴露于艾滋病毒在较低的免疫激活但仍然未感染的^24,25，和这个静态的表型是在FGT ¹⁴还观察到。在这里，我们描述的方法进行处理，并通过评估体外流式细胞仪来源于宫颈cytobrushes CMC样品中的T细胞活化。

研究方案

伦理声明:曼尼托巴大学及内罗毕肯雅塔的国家医院/大学研究伦理委员会批准了这项研究，并签署知情同意从所有研究参与者获得。

媒体1。准备和CMC收集管

1. 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（137.93 mM氯化钠，2.67毫米氯化钾，8.1毫米的Na ₂ HPO _4，1.47 mM的KH ₂ PO _4）。高压灭菌无菌。这可以被存储在4℃几个月。
2. 预等分5毫升PBS入50ml Falcon管（每个样品1被收集），并在4℃储存直至样品收集时间。
3. 标签每个样品2-4冻存管或1.5 ml离心管中，以收集灌洗液进行存储。
4. 制备细胞培养基:RPMI 1640 +1％青霉素/链霉素/两性霉素B（终浓度为100单位/毫升，100微克/毫升和250纳克/毫升，respectiv伊利，没有FC / FB的补充。

细胞刷样品2。收藏

收集细胞刷样本是必须由一个受过训练的医师或妇科医生进行非侵入性的过程。

1. 同时使用细胞刷和一个木制或塑料刮板收集宫颈单个核细胞（CMC）。通过将刮刀与周围的宫颈内口的旋转（ 图1）收集的CMC从下窥器检查参与者。将细胞刷入颈管口，旋转360°，并立即放置两个细胞刷和刮具入含有5ml的PBS 50ml的falcon管。
2. 保持样品在冰/ 4℃，直到处理。为了保持细胞活力，处理样品在2小时内收集的。
3. 如果可能的话，收集绿色的顶部肝素真空采血管的外周血单个核细胞（PBMC）中分离，作为一个比较器/控制CMC分析匹配的血液样本。

中医诊所3。隔离

在生物安全二级实验室进行样品处理，在无菌生物安全柜，双层手套。

1. 在收集，中央军委样本可能被污染的血液。排除具有从研究可见血液污染的样品，以防止混淆列入PBMC的最终样品中。由于淋巴细胞管委会样本中分离出的低号，次血液污染可以很容易地压倒管委会淋巴细胞组成部分。
2. 涡猎鹰管含有的细胞刷及刮刀45秒，从刷游离细胞。在此过程中样品可能成为泡沫状;这是正常的。
3. 使用细胞刷刮任何遗留物质掉刮板，并丢弃刮成漂白剂溶液。收集剩余附着在刷/刮刀的任何单元格，使用新鲜的手套挤拇指和食指之间的刮刀。滑下刷，使细胞和PBS，并收集在同一个50ml管中。丢弃细胞刷成漂白剂溶液，并丢弃的手套。
   重要提示:使用一个新的手套对每个样品。
4. 适合100微米尼龙细胞过滤到新的50ml falcon管。使用移液管，收集从样品管中的PBS-细胞悬浮液，并通过过滤器到干净试管中进行过滤。
5. 加入5 ml的RPMI 1640中，以原始样品管中。使用移液管，洗样品管的侧面与RPMI，并通过过滤器转移到新的收集管。洗尼龙过滤器的RPMI的底部为好。
6. 离心样品10分钟，在514×g下。关键的是要在该步骤中离开离心机制动切断，以防止在CMC粒料撞出。
7. 轻轻地从管取出上清液，注意不要打扰颗粒。颗粒大小会变化很大;在这样我的样品，将沉淀是由于大量上皮细胞的存在相当大的，而在其他情况下，将丸粒是勉强可见和高透明度。
8. 由猎鹰管轻轻搅动悬浮颗粒。加入5毫升的PBS洗涤样品。
9. 再次离心在514 XG没有离心制动器10分钟。
10. 小心弃去上清液并重新悬浮沉淀如上述。这些细胞是准备或者冷冻保存（使用PBMC冷冻保存协议），刺激或流式细胞仪分型。

4，CMC表面染色和流式细胞仪

1. 从在100μl封闭液的步骤3.10重悬沉淀并转移要么到96孔板或FACS管。封闭液（方框Fcγ受体）的配方如下:1.8微升小鼠IgG（最终浓度0.2微克/微升），5微升的FBS和93.2微升FACS洗涤液（PBS +2％FBS）中。染色可在96孔板中进行，如果粒料的大小是足够小的，但可能需要在FACS管中进行，如果颗粒是常规大。它相应滴定抗体是很重要的。
2. 阻断样品在冰上/ 10分钟，在4℃下
3. 在96孔板中加入100μlFACS洗涤液（PBS +2％FBS）中，或加入500μl在FACS管洗​​涤细胞。离心机在600×g下在4℃下10分钟，使用于低制动（或关闭，如果低速制动器设置是不可用的）。
4. 除去上清液和重悬细胞沉淀通过搅拌。添加活力染色（现场死可以解决的可行性染料）。根据制造商的说明制备的可行性染料。它可能需要被滴定为在每个实验/流式细胞仪的设置使用。孵育在黑暗中30分钟，在4℃下
5. 洗涤细胞100μl/500微升PBS（对于96孔板/ FACS管）。离心600×g离心10分钟，低/无刹车。删除supernatan吨，重悬细胞。
6. 孵育细胞表面标记的抗体的混合物，在100微升的总体积。重要提示:优化和滴定样品染色前各流式细胞仪面板。孵育细胞在黑暗中30分钟，在4℃下
7. 重复步骤4.5。如果染色在96 - 孔板中，细胞转移到FACS管中，并稀释至750微升FACS洗涤的含1％多聚甲醛（PFA）的最终体积（或CytoFix，稀释1中4）。进行数据采集的流式细胞仪。

5，收集和宫颈阴道灌洗的制备（CVL）

1. 此前细胞刷取样，用注射器2毫升无菌PBS冲洗宫颈内口和阴道后穹窿吸出灌洗。
2. 吸气式灌洗样品收集到15毫升猎鹰管并保持在冰上/ 4℃，直到处理。
3. 在400×g离心7分钟，以除去细胞碎片离心样品。
4. 合作llect上清液，等分试样的样品为1毫升或500微升的等分试样，并储存于-70℃。等分可以解冻ELISA或CVL蛋白微球阵列分析，但要避免多次冻结/解冻周期。
5. 如果需要的话，重悬细胞碎片的沉淀物中的RNA后来由以下制造商的方案来测量RNA表达。

6，数据采集

1. 准备一套补偿管的抗体面板相匹配。运行补偿管调节光谱重叠。运行样品上的任何多色流式细胞仪被配置在面板中使用的荧光标记抗体。
2. 首先获取PBMC样本调整前向散射（FSC）和侧向散射光（SSC）电压，以检测淋巴细胞群。尽量让他们在100上每个轴的线性刻度。运行PBMC控制将使显著更容易找到管委会淋巴细胞群。
3. 对于CMC样品FSC的门槛可能需要相对增加至因涂抹了SSC轴在低FSC值PBMC样品。
4. 收购之前，每个涡管。获得整个管最大化收集淋巴细胞门事件的数目。监控机器小心，以免堵塞。
5. 将数据导出到流式细胞仪分析程序，如FlowJo。

7，门控策略

1. 选择正向侧向散射高（FSC-H）/正向侧向散射面积（FSC-A）来确定单人口。
2. 选择时间与荧光标记（如例如FITC）来控制收购质量。变化的流量可能引入的数据失真。排除显示差异流速的任何区域。
3. 标识上SSC-A/FSC-A情节淋巴细胞群。用PBMC控制，以方便识别。需要注意的是管委会淋巴细胞群可能不一样清晰的PBMC控制。
4. 门上SSC-A/viability染料排除死细胞与活细胞。死细胞可以非特异性结合的抗体，其中将介绍文物。
5. 门上的SSC-A/CD3识别的T细胞群体。从这个门，确定CD4 +和CD8 +的人群。

结果

多参数流式细胞仪是一种功能强大的工具来剖析细胞亚群的表型和功能在以前未知的组织。 CMC样品的分析可以产生两个淋巴细胞和单核细胞的人口信息与相应的门控策略。

一位代表中央军委门控策略，相比匹配的PBMC轮廓， 如图2，FSC-A与FSC-H的情节使得细胞双峰，这是非常普遍的CMC样品相比，外周血单个核细胞的排斥，甚至是过滤后（ 图2A）。质量?...

讨论

面对庞大的知识差距的相对免疫力在女性生殖道（FGT），中医诊所的表型分析可以提供见解的各种各样成多个淋巴细胞群在子宫颈​​。再加上蛋白质组分析及在宫颈灌洗病毒载量的测量，抗干扰性性传播感染（STI）s和其他病原体可在解剖不同人群。

技术因素-中医诊所:隔离和CMC样品成功染色是具有挑战性的。在CMC收集协议的优化强调第一收集CVL的有效性，随?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant