컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

요약

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

초록

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

서문

새로운 HIV 감염의 대부분은 전 세계적으로 여성은 2011 년 (UNAIDS ¹⁾ 새로운 감염의 47 %를 대표로, 이성애 전송을 통해 발생한다. 여성의 생식기 (FGT), HIV 및 기타 성병 병원체의 주 진입 포털 중 하나를 이해, 감염을 방지하기 위해 효과적인 전략을 찾는 경로에 높은 중요하다. 생식기 점막의 면역 반응은 분명히 독특하고 말초 혈액 ^2에서 측정 다릅니다. 그러나, FGT에서 면역 역학의 현재의 지식은 기껏해야 제한됩니다. 현재까지, 점막 면역 환경의 연구는 대부분이 감염 다음과 같은 점막 조직에서 초기 이벤트 이후 질병의 진행 ^3,4에 큰 영향을 미칠 것이 분명되고있다 창자 관련 림프 조직 (GALT)에 초점을 맞추고있다. 생식기 점막에서 샘플을 수집하는 것은 큰 도전을 나타내고 락 적어도 부분적으로 책임이있다FGT의 면역학의 이해 K. FGT이 로케일에서 샘플을 수집하고 분석하기위한 효율적인 방법을 필요로 한 독특한 환경의 맥락에서 호스트와 병원체의 면역 동적으로 퍼즐을 해결.

FGT는 두 개의 섹션으로 나누어 져 나팔관, 자궁 내막과 자궁 경부, 그리고 ectocervix을 포함하는 낮은 요로와 질을 포함하는 상부 생식기 (Kaushic 검토를 등 ^5). 그것은 서로 다른 사이트의 상대적 기여도는 HIV 감염에 무엇 아직 불분명하지만, 그것은 두 사이트 모두 HIV 항목 ^6에 기여할 수 있다고 믿고 있습니다. T 세포는 대 식세포가 (로드 리 게스 - 가르시아 검토 등 ²⁾ 약 10 %를 포함하는 동안, 상단과 하단의 생식 책자에서 백혈구 40 ~ 50 %를 차지한다. T 세포는 질, 경부, 자궁 내막 및 검출 할 수있다. 대 식세포는 더 강하게 locali 있습니다그들은 두 조직에서 검출 될 수 있지만, 자궁 경부보다 자궁 내막 및 자궁 근층 결합 조직에 제드 자형. 마지막으로, plasmacytoid 수지상 세포 (PDCS) 및 랑게르한스 세포는 또한 FGT 조직에서 검출 될 수있다. 표현형 및 면역 인구 및 HIV 감염에 감수성의 비율은 호르몬주기에 따라 중요하게 다를 수 있습니다, 호르몬 피임약, 세균성 질염이나 성적 활동 ^5,7-9의 사용.

다양한 방법 FGT의 면역 인구와 환경을 연구하기 위해 개발되었다. 자궁 경부 조직 검사, 자궁 및 자궁 경부 cytobrushes lavages (CVL) ^{10 ~ 12은} 가장 일반적으로 문헌에서 사용할 수 있습니다. PBS의 세척에 의한 CVL 컬렉션은 간단한 방법이며, 매우 낮은 세포 수율 면역 조절 성 단백질 만, 결과의 연구를 허용하고, 따라서 FGT ^(13)의 면역 세포 집단을 공부에 적합하지 않습니다. CVL 샘플은, 반면에, 아르 V이러한 ELISA, 사이토킨 비드 어레이 ⁽¹⁴⁾ 또는 질량 분석 등의 방법 ^{(15, 16)를} 사용하여 각종 사이토킨, 케 모킨 또는 항균 인자의 발현을 측정함으로써 FGT의 면역 환경을 평가하기위한 유용한 ERY. 면역 세포 주파수, 표현형과 기능의 특성은 자궁 cytobrush 또는 자궁 경부 생검 표본 추출에 의해 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집하여 달성 될 수있다.

자궁 경부 생검의 샘플링은 출혈의 불편과 위험을 증가와 여자 ^(12)의 면역 상태에 따라 절차에 따라 치료 2~11일 소요 침습적 방법이다. 한편, 자궁 cytobrushes는 수집 세포의 낮은 수율에도 불구하고, FGT로부터 면역 세포를 수집하기 위해 덜 침습적 더 편리한 방법이다. 두 가지 방법은 CD45 + 백혈구의 동일한 수율에 도달 할 수 있지만, 두 개의 연속 자궁 cytobrushes가 포함 된 세포의 동일한 금액을 얻기 위해 필요한 IN 한 생검 ^13. 그럼에도 불구하고, cytobrush 샘플링은 여전히 ¹⁴ 유동 세포 계측법에 의해 추가로 생체 표현형에 대한 세포의 수용 수 (약 5,000 CD45 + 세포 / cytobrush)를 제공합니다. 자극 세포 유세포 또는 qPCR에 HIV가 특정 면역 반응 ⁽¹⁷⁾ 또는 토륨 셀 ^{(18)의 편광을} 식별 cytobrush 유래의 CMC를 사용하여 수행되었다로서 또한 기능적인 특성은,이 샘플들에 수행 될 수있다. T 세포 인구의 팽창은 또한 CMC를 ^19으로 기능적 연구를 용이하게 할 수있다.

그것은 생검 및 cytobrushes는 FGT의 별개의 부분을 샘플링하는 것이 중요합니다. 자궁 cytobrushes은 자궁 경부와 아마 변환 영역의 상피 세포에서 파생 된 세포를 수집, 자궁 OS를 샘플링하면서 생검은 ectocervix ^{(12, 13)의} 상피 세포와 기질의 우수한 부분에서 파생됩니다. Cytobrush 샘플 따라서 재를 샘플링조직 검사는 편평 층상 상피 ⁵ 줄 지어 영역을 포함하는 동안 기온은 원주 상피 세포의 단일 층으로 구성. 그 결과, 자궁 경부 생검 및 cytobrush 의해 수집 백혈구 집단의 특성은 다르다. cytobrushes는 CD14 + 단핵 세포 / 대 식세포 ^(13)의 높은 비율의 컬렉션에 발생하는 반면 생검, CD3 + T 세포의 높은 비율을 수집합니다.

FGT의 면역학을 공부하는 것은 많은 년간 ^{20 ~ 22에} 대한 관심이었다 우리는 cytobrush 파생 CMC를 연구와 전문 지식의 큰 거래를 축적했다. 우리의 연구는 HIV에 감염된 감염되지 않은 및 HIV에 노출 된 혈청 음성 나이로비, 케냐 (HESN) 여성 성 노동자의 연구에 주로 초점을 맞추고있다. HIV는 우선적으로 FGT에 HIV 대상이 될 수있는 활성화 된 세포의 ²³ 숫자가 낮아 HIV 취득에 대한 보호에 기여할 수있는 활성화 된 T 세포에 복제합니다. 이 가설 여러 스투과 일치에스 아직 감염되지 않은 ^{24, 25을} 유지하며,이 대기 표현형도 FGT ^14에서 관찰되는 높은 HIV에 노출 된 HESN의 성 노동자들 사이 낮은 면역 활성화를 설명했다. 여기, 우리는 처리 방법을 설명하고 생체 유동 세포 계측법에 의해 자궁 경부 cytobrushes에서 파생 된 CMC 샘플에서 T 세포의 활성화를 평가.

프로토콜

윤리 문 : 매니토바 대학교 및 나이로비의 케냐 타 국립 병원 / 대학 모두의 연구 윤리 보드는이 연구를 승인하고 서면 동의서는 모든 연구 참가자로부터 얻은 것입니다.

1. 매체의 제조 및 CMC 수집 관

1. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137.93 mM의 염화나트륨, 2.67 밀리미터의 KCl, 8.1 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.47 mM의 KH ₂ PO _4)를 준비합니다. 불임에 대한 압력솥. 이것은 몇 달 동안 4 º C에 저장할 수 있습니다.
2. 미리 나누어지는 5 ㎖의 PBS로 50 ML 팔콘 튜브 (수집 할 샘플 당 하나)와 4 º C에서 저장 샘플 수집 시간까지.
3. 저장을위한 세척을 수집하는 샘플 당 2 ~ 4 cryovials 또는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 레이블을 지정합니다.
4. 세포 배양 매체를 준비 RPMI 1640 + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B (최종 농도 100 단위 / ㎖, 100 ㎍ / ㎖ 및 250 겨 / ㎖, respectiv더 FCS / FBS와 엘리는 덧붙였다.

Cytobrush 샘플 2. 컬렉션

cytobrush 샘플 컬렉션은 훈련 MD 또는 산부인과 의사에 의해 수행되어야하는 비 침습 절차입니다.

1. cytobrush와 나무 또는 플라스틱 긁는 도구를 모두 사용하여 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집합니다. (그림 1) 긁는 도구를 삽입하고 자궁 OS 중심으로 회전하여 검경 시험에서 참가자에서 CMC를 수집합니다. , 자궁 경부 OS에 cytobrush를 삽입 360 ° 회전, 즉시 PBS의 5 ML을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 cytobrush 스크레이퍼를 모두 배치합니다.
2. 처리까지 4 º C에서 / 얼음에 샘플을 보관하십시오. 컬렉션의 2 시간에서 세포 생존 능력, 공정 샘플을 유지합니다.
3. 가능하면 말초 혈액 단핵 세포 CMC 분석을위한 비교 / 제어 역할을하는 (PBMC) 분리를위한 녹색 최고 헤파린 vacutainers에 일치하는 혈액 샘플을 수집합니다.

CMC를 3. 분리

이중 장갑 멸균 생물 안전 캐비닛, 바이오 안전성 수준이 실험실에서 시료 처리를 수행합니다.

1. 수집하는 동안, CMC 샘플은 혈액에 오염 될 수 있습니다. 최종 샘플 PBMC의 혼란 포함을 방지하기 위하여 연구 결과에서 볼 혈액 오염과 샘플을 제외. 인해 CMC 샘플로부터 단리 림프구의 낮은 숫자로, 사소한 혈액 오염을 쉽게 CMC 림프구 성분을 압도 할 수있다.
2. 브러쉬에서 세포를 떼어 놓다 45 초 cytobrush 스크레이퍼를 모두 포함 소용돌이 팔콘 튜브. 샘플은이 과정에서 거품이 될 수있다; 이것은 정상입니다.
3. 스크레이퍼 떨어져 남아있는 재료를 긁어 및 표백 용액에 스크레이퍼를 폐기 cytobrush를 사용합니다. 브러쉬 / 스크레이퍼에 붙어 남아있는 세포를 수집하려면, 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 스크레이퍼를 짜내 신선한 장갑을 사용합니다.세포와 PBS가 동일한 50 ㎖ 튜브에 수집 될 수 있도록 브러시를 밀어. 표백제 용액에 cytobrush를 폐기하고, 장갑을 버린다.
   중요 : 각 샘플에 대한 새로운 장갑을 사용하십시오.
4. 신선한 50 ML 팔콘 튜브에 100 μm의 나일론 셀 스트레이너를 장착한다. 전달 피펫을 사용하여, 샘플 튜브에서 PBS-세포 현탁액을 수집하고 새로운 튜브로 여과기를 통해 고를.
5. 원래 샘플 튜브에 RPMI 1640 5 ML을 추가합니다. 전송 피펫을 사용하여 RPMI로 샘플 튜브의 측면을 씻어 새 컬렉션 튜브에 필터를 통해 전송합니다. 뿐만 아니라 RPMI와 나일론 필터의 바닥을 세척 할 것.
6. 514 X g에서 10 분 동안 원심 분리. 이것은 CMC 펠릿 빠지을 방지하기 위하여,이 단계 동안 원심 브레이크를 남겨두기 위하여 중요하다.
7. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛의 크기는 매우 다양 할 것이다; 그래서의다른 경우에, 펠릿이 거의 보이지 및 고투명 동안 저 샘플은 펠릿 인해 상피 세포의 많은 수의 존재로 상당히 크다.
8. 팔콘 튜브의 부드러운 교반하여 펠렛을 Resuspend. 샘플을 씻어 PBS의 5 ML을 추가합니다.
9. 아니 원심 브레이크와 514 XG에 10 분 다시 원심 분리기.
10. 조심스럽게 뜨는을 취소하고 위의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 세포 (PBMC의 냉동 보존 프로토콜을 사용하여) 냉동 보존, 자극 또는 표현형 유동 세포 계측법 중 하나에 대한 준비가되어 있습니다.

4. CMC 표면의 얼룩 및 유동 세포 계측법

1. 차단 용액 100 μL 3.10 단계에서 펠렛을 재현 탁하고 96 - 웰 플레이트 또는 FACS 튜브 내로 하나 옮긴다. 차단 솔루션 (Fcγ 수용체를 차단하기 위해) 다음과 같은 조리법은 : 1.8 ㎕의 마우스 IgG의 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL), 5 μL의 FBS 93.2 ㎕의 FACS 세척 (PBS 2 % FBS).염색법은 펠릿 크기가 충분히 작은 경우에 96 웰 플레이트에서 수행 될 수 있지만, 펠릿 일상적 큰 경우 FACS 튜브에서 수행 될 필요가있다. 그에 따라 항체를 적정하는 것이 중요합니다.
2. 4 ℃에서 얼음 / 10 분의 샘플을 차단
3. 96 - 웰 플레이트에 FACS 워시 (PBS 2 %의 FBS) 100 μL, 또는 FACS 튜브에 500 ㎕ 씩 세포를 씻으십시오. 최저 브레이크와 4 ° C에서 10 분 600 XG에 원심 분리기 (끄거나, 낮은 브레이크 설정을 사용할 수없는 경우가).
4. 뜨는을 제거하고 교반하여 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 생존의 얼룩 (라이브 죽은 고칠 가능성 염료)를 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 생존의 염료를 준비합니다. 각 실험실 / 사이토 설치에 사용하기 위해 적정해야 할 수 있습니다. 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 알을 품다
5. (96 - 웰 플레이트 / FACS 튜브의 경우) 세포에게 PBS 100 μl/500 μl를 씻으십시오. 저 / 노 브레이크 10 분 600 XG에 원심 분리기. supernatan를 제거T와에 resuspend 세포.
6. 100 μL의 총 부피, 표면 마커 항체의 칵테일 세포를 품어. 중요 : 최적화 및 염색을 샘플링하기 전에 패널 세포 계측법 각 흐름을 적정한다. 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 세포를 품어
7. 4.5 단계를 반복합니다. FACS 튜브에 96 - 웰 플레이트, 전사 셀에 염색하고 1 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 FACS 세척 750 μL의 최종 부피로 희석 (또는 CytoFix을 소재 1 희석). 유동 세포 계수기에 데이터 수집을 진행합니다.

5. 수집 및 자궁 경부 질 세척의 준비 (CVL)

1. 샘플링을 cytobrush하기 전에, 멸균 PBS의 2 ㎖로 자궁 경부 씻어 후방 원개에서 세척을 흡인하기 위해 주사기를 사용합니다.
2. 15 ML 팔콘 튜브에 흡입 된 세척 샘플을 수집하고 처리 할 때까지 4 º C에서 / 얼음 계속.
3. 세포 파편을 제거하는 7 분 400 XG에 샘플을 원심 분리기.
4. 공동-70 ℃에서 1 ㎖ 또는 500 μL 씩 분주하고, 가게에 뜨는 나누어지는에게 샘플을 llect 분취 량은 ELISA 또는 CVL 단백질의 비드 어레이 분석 해동 만 체류 냉동 / 해동 사이클을 피할 수있다.
5. 원하는 경우, 제조자의 프로토콜에 따라 RNA의 발현을 측정하기 위해 나중에 RNA에서 세포 파편의 펠렛을 재현 탁.

6. 데이터 수집

1. 항체 패널 일치 보상 튜브 세트를 준비한다. 스펙트럼 중복을 조정 보상 튜브를 실행합니다. 그 사이토 어떤 여러 가지 빛깔의 흐름에 샘플을 실행은 패널에 사용되는 형광 색소 결합 된 항체에 대해 구성됩니다.
2. 림프구 집단을 검출하기 위해 순방향 캐터 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC)의 전압을 조정하는 제 PBMC 시료를 획득. 리니어 스케일의 각 축 (100)에 그들을 유지하십시오. PBMC 제어를 실행하면 상당히 쉽게 CMC 림프구 인구를 찾을 수 있습니다.
3. CMC 샘플에 대한 FSC 임계 값은 낮은 FSC의 값에 SSC 축을 얼룩에 의한 PBMC 샘플에 상대적으로 증가해야 할 수 있습니다.
4. 취득하기 전에 각 튜브를 소용돌이. 수집 된 림프구 게이트 이벤트의 수를 최대화 할 전체 튜브를 획득. 막힘을 방지하기 위해주의 깊게 시스템을 모니터링합니다.
5. 그러한 FlowJo 같은 유세포 분석 프로그램으로 데이터를 내보낼.

7. 게이팅 전략

1. 고 앞으로 측면 산란 (FSC-H)을 선택 / 앞으로 측면 산란 영역 (FSC-A) 중항 인구를 결정합니다.
2. 인수의 품질을 제어하기 위해 (예를 FITC로) 형광 마커 대 시간을 선택합니다. 유량의 변화는 데이터에 유물을 소개 할 수 있습니다. 유량의 차이를 보여줍니다 어떤 지역을 제외합니다.
3. SSC-A/FSC-A 플롯의 림프구 인구를 확인합니다. 식별을 용이하게하기 위해 PBMC 컨트롤을 사용합니다. CMC 림프구 인구가 PBMC 제어와 같은 명확하지 않을 수 있습니다.
4. SSC-A/viability에 게이트는 살아있는 세포에서 죽은 세포를 제외 염색. 죽은 세포가 아닌 구체적으로 유물을 소개하는 항체를 통합 할 수 있습니다.
5. SSC-A/CD3에 게이트는 T 세포 인구를 식별 할 수 있습니다. 이 게이트에서 CD4 +와 CD8 + 인구를 식별합니다.

결과

다 항목 유동 세포 계측법은 이전에 uncharacterized 조직에서 세포 부분 집합의 표현형과 기능을 해부 할 수있는 강력한 도구입니다. CMC의 샘플 분석은 적절한 게이팅 전략 림프구 및 단핵구 집단 모두에 대한 정보를 얻을 수있다.

대표적인 CMC 게이팅 전략, 일치 PBMC 프로파일에 비해, 그림 2와 같다. FSC-H 플롯 대 FSC-A도 여과 한 후, PBMC에 비해 CMC 샘플에서 매우 널리 ?...

토론

여성의 생식기 (FGT)에서 내성에 대한 지식의 큰 격차를 감안할 때, CMC를의 표현형 분석은 자궁 경부에있는 다수의 림프구 집단에 대한 통찰력의 다양한 배열을 제공 할 수 있습니다. 프로테옴 분석 및 자궁 세척에서 바이러스 부하 측정과 함께, 성병 감염 (STI)의 다른 병원균에 대한 면역은 다양한 인구에서 해부 할 수 있습니다.

기술적 고려 사항 - CMC를가 : 분리 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant