Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Zusammenfassung

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Zusammenfassung

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Einleitung

Die Mehrheit der HIV-Neuinfektionen weltweit durch heterosexuelle Übertragung entstehen, mit Frauen, die 47% der Neuinfektionen im Jahr 2011 (UNAIDS ^1). Das Verständnis der weiblichen Genitaltraktes (FGT), einer der Haupteingangsportale für HIV und andere sexuell übertragbare Erreger, ist von großer Bedeutung auf dem Weg zur Suche nach effizienten Strategien, um Infektionen zu vermeiden. Immunantworten im Genitalschleimhaut deutlich einzigartig und unterscheiden sich von denjenigen im peripheren Blut ² gemessen. Allerdings ist die Kenntnis der aktuellen Immundynamik an der FGT allenfalls begrenzt. Bisher haben Studien der Schleimhautimmun Umwelt weitgehend auf den Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT), wo es ist klar geworden, dass die frühen Ereignisse im Schleimhautgewebe nach der Infektion einen starken Einfluss auf nachfolgende Fortschreiten der Krankheit ^3,4 haben konzentriert. Sammelproben aus der Genitalschleimhaut stellt eine große Herausforderung und ist zumindest teilweise verantwortlich für die lack Verständnis der Immunologie der FGT. Die Lösung des Rätsels der Immun Dynamik zwischen Wirt und Pathogen in Zusammenhang mit der Umwelt, die die unterschiedlichen FGT erfordert effiziente Methoden zur Erfassung und Analyse von Proben aus diesem Gebietsschema ist.

Die FGT ist in zwei Abschnitte unterteilt: der obere Fortpflanzungsorgane, die die Eileiter, Endometrium und Endocervix und den unteren Darm-Trakt, die die Ektozervix enthält und die Vagina enthält (von Kaushic prüft et al ^5). Es ist immer noch unklar, was der relative Beitrag dieser verschiedenen Websites ist es, HIV-Infektion, aber es wird angenommen, dass beide Seiten könnten, um HIV-Eintritt ⁶ beitragen. T-Zellen repräsentieren 40-50% der Leukozyten in den oberen und unteren Fortpflanzungsorgane, während Makrophagen umfassen ca. 10% (in Rodriguez-Garcia et al Bewertung ^2). T-Zellen können in der Vagina, Gebärmutterhals, Endometrium nachgewiesen werden. Makrophagen sind stärker localiim Endometrium und Myometrium-Bindegewebe als der Zervix zed, obwohl sie in beiden Geweben nachgewiesen werden. Schließlich kann plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) und Langerhans-Zellen auch in FGT Gewebe nachgewiesen werden. Der Phänotyp und Proportionen von Immun Populationen und ihrer Anfälligkeit für eine HIV-Infektion kann allem je nach Hormonzyklen, die Verwendung von hormonellen Kontrazeptiva, bakterielle Vaginose oder sexuelle Aktivitäten ^5,7-9.

Diverse Verfahren sind entwickelt worden, um die Immun Populationen und der Umgebung des FGT studieren. Cervical Biopsie-, Gebärmutterhals-und cytobrushes zervikovaginalen Spülungen (CVL) ^10-12 sind die am häufigsten in der Literatur verwendet. CVL Sammlung von PBS Spülung ist das einfachste Verfahren und erlaubt die Untersuchung der immunmodulierenden Proteine ​​führt jedoch zu extrem niedrigen Zellausbeute und eignet sich deshalb nicht für die Untersuchung der Immunzellpopulationen der FGT ^13. CVL Proben andererseits vEry nützlich für die Bewertung der Immun Umgebung der FGT durch Messung der Expression von verschiedenen Zytokinen, Chemokinen oder antimikrobielle Faktoren unter Verwendung von Verfahren, wie ELISA, Cytokin Perlenanordnung ¹⁴ oder Massenspektrometrie ^15,16. Charakterisierung der Immunzellfrequenzen Phänotypen und Funktionen können durch Sammeln zervikalen mononukleären Zellen (CMC), durch zervikale Zytobürste oder durch zervikale Biopsieprobennahme erreicht wird.

Cervical Biopsien ist eine invasive Methode, die die Beschwerden und das Risiko von Blutungen erhöht und nimmt 2 bis 11 Tage, um zu heilen nach dem Verfahren je nach Immunstatus der Frau ^12. Auf der anderen Seite, Gebärmutterhals cytobrushes trotz der geringeren Ausbeute an Zellen gesammelt, ist eine weniger invasive und bequeme Methode, um die Immunzellen aus dem FGT sammeln. Beide Verfahren können die gleiche Ausbeute an CD45 +-Leukozyten zu erreichen, aber zwei aufeinander zervikalen cytobrushes sind notwendig, um die gleiche Menge an Zellen enthielt, erhalten wurde in ein ^Biopsie-13. Dennoch bietet immer noch Zytobürste Probenahme eine zulässige Anzahl von Zellen (etwa 5000 Zellen CD45 + / Zytobürste) für weitere ex vivo Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie ^14. Außerdem können funktionelle Charakterisierung an diesen Proben durchgeführt werden, wie Stimulation und intrazelluläre Durchflusszytometrie oder qPCR wurden unter Verwendung von CMCs Zytobürste abgeleiteten HIV-spezifischen Immunantworten ¹⁷ oder Th-Zell-Polarisation ¹⁸ zu identifizieren. Erweiterung der T-Zellen können auch Bevölkerung erleichtern funktionelle Studien mit CMC ^19.

Es ist wichtig zu beachten, dass Biopsien und cytobrushes Probe unterschiedliche Abschnitte der FGT. Biopsien sind von der überlegenen Teil des Epithel und Stroma der Ektozervix ^12,13 abgeleitet, während Gebärmutterhalskrebs cytobrushes probieren Sie die Muttermundes, Sammeln von Zellen aus dem Epithel der Endocervix und vermutlich der Transformationszone abgeleitet. Cytobrush Proben daher probieren Sie eine Wiedergion aus einer einzigen Schicht von Epithel besteht, während Biopsien, umfassen einen Bereich von einem geschichteten Plattenepithel Epithel ⁵ ausgekleidet. Als Folge der Natur der Leukozyten-Populationen durch zervikale Biopsie und Zytobürste gesammelt unterscheidet. Biopsien sammeln einen höheren Anteil an CD3 +-T-Zellen, während cytobrushes führen Sammlung von einem höheren Anteil an CD14 + Monozyten / Makrophagen ^13.

Das Studium der Immunologie der FGT ist seit vielen Jahren ^20-22 ein Interesse, und wir haben viel Know-how mit dem Studium der Cytobrush abgeleitete CMC angesammelt. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich vor allem auf die Untersuchung von HIV-infizierten, nicht-infizierten und HIV-seronegativen ausgesetzt (HESN) Sexarbeiterinnen aus Nairobi, Kenia. HIV repliziert vorzugsweise in aktivierten T-Zellen ²³ und eine geringere Anzahl an aktivierten Zellen, die von HIV in der FGT richtet werden kann, könnte den Schutz vor HIV-Ansteckung bei. Im Einklang mit dieser Hypothese mehrere studies wurden geringere Immunaktivierung unter HESN Sexarbeiterinnen, die hoch HIV ausgesetzt werden beschrieben bleiben doch nicht infizierten ^24,25, und das Ruhe Phänotyp ist auch in der FGT ¹⁴ beobachtet. Hier beschreiben wir Methodik für die Verarbeitung und Bewertung von T-Zellen-Aktivierung in CMC-Proben von Gebärmutterhalskrebs cytobrushes durch ex vivo Durchflusszytometrie abgeleitet.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Die Forschungsethik Vorstand von der Universität von Manitoba und Kenyatta National Hospital / University of Nairobi genehmigt diese Studie und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Studienteilnehmern erhalten.

1. Vorbereitung der Medien und CMC Röhrchen

1. Vorbereitung phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM KH ₂ PO _4). Autoklav zum Sterilität. Dies kann bei 4 º C mehrere Monate gelagert werden.
2. Pre-aliquote 5 ml PBS in 50 ml Falcon-Röhrchen (eine pro Probe gesammelt werden) und bei 4 º C bis zur Probenentnahme Zeit.
3. Beschriften 2-4 Kryoröhrchen oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe Spülung für die Lagerung zu sammeln.
4. Vorbereitung Zellkulturmedien: RPMI 1640 + 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B (Endkonzentration 100 Einheiten / ml, 100 ug / ml und 250 ng / ml, je wEly, ohne FCS / FBS aufgenommen.

2. Sammlung von Proben Cytobrush

Sammlung von Proben Zytobürste ist ein nicht-invasives Verfahren, das von einem geschulten MD oder Gynäkologen durchgeführt werden müssen.

1. Sammeln Gebärmutterhalskrebs mononuklearen Zellen (CMC) unter Verwendung sowohl einer Cytobrush und einem Holz-oder Kunststoffschaber. Sammeln CMC vom Teilnehmer unter Spekulumuntersuchung, indem Sie den Schaber und rund um den Muttermund dreht (Abbildung 1). Legen Sie die Cytobrush in die endocervical-Betriebssystem, um 360 ° drehen und sofort legen sowohl die Cytobrush und Schaber in die 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 5 ml PBS.
2. Halten Proben auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung. Um die Lebensfähigkeit der Zellen, Prozessproben innerhalb von 2 h Sammlung aufrecht zu erhalten.
3. Wenn möglich, sammeln abgestimmt Blutproben in grüne Spitze Heparin-Vacutainer für periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) Isolierung als Komparator / Steuerung für CMC-Analyse dienen.

3. Isolierung von CMC

Führen Sie die Probenverarbeitung in einem Labor der Sicherheitsstufe 2, in einer sterilen Biosicherheitsschrank mit Flügelhandschuhe.

1. Bei der Abholung kann CMC kontaminierten Proben mit Blut zu werden. Proben mit sichtbaren Blutkontamination aus der Studie ausschließen, um verwirrende Einbeziehung von PBMC in der letzten Probe zu verhindern. Aufgrund der geringen Anzahl von Lymphozyten von CMC-Proben isoliert, können kleine Blutkontamination leicht überwältigen die CMC-Lymphozyten-Komponente.
2. Wirbel-Falcon-Röhrchen, die sowohl das Zytobürste und Abstreifer für 45 Sekunden, um Zellen von den Bürsten zu dissoziieren. Proben können schaumig während dieses Prozesses zu werden; das ist normal.
3. Verwenden Sie die Cytobrush, um alle verbleibenden Material aus dem Schaber abkratzen, und entsorgen Sie die Schaber in ein Bleichmittel-Lösung. Um alle Zellen bleiben auf den Pinsel / Schaber angebracht sammeln, verwenden Sie einen frischen Handschuh, den Schaber zwischen Daumen und Zeigefinger zusammendrücken.Schieben Sie die Bürste, so dass die Zellen und PBS in der gleichen 50-ml-Tube gesammelt werden. Entsorgen Sie die Cytobrush in eine Bleichlösung, und entsorgen Sie den Handschuh.
   WICHTIG: Verwenden Sie einen neuen Handschuh für jede Probe.
4. Setzen Sie einen 100 um Nylon Zelle Sieb, um ein frisches 50 ml Falcon-Röhrchen. Verwendung einer Transferpipette, sammeln die PBS-Zellsuspension aus dem Probenröhrchen und dem Filter durch das Sieb in die frisches Röhrchen.
5. 5 ml RPMI 1640 auf die ursprüngliche Probenröhrchen. Mit der Transferpipette, waschen Sie die Seiten der Probenröhrchen mit der RPMI und übertragen durch den Filter auf das neue Sammelröhrchen. Und wäscht den Boden der Nylonfilter mit RPMI.
6. Zentrifugieren der Proben für 10 min bei 514 x g. Es ist entscheidend, um die Zentrifuge Brems aufhören bei diesem Schritt, um Herausziehen der CMC Pellet verhindern.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der Röhre, kümmert sich um das Pellet nicht zu stören. Pelletgröße sehr unterschiedlich sein; in some Proben wird das Pellet ziemlich groß aufgrund der Anwesenheit einer großen Zahl von Epithelzellen, während in anderen Fällen ist das Pellet kaum sichtbar und hochtransparent.
8. Das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Falcon-Röhrchen. 5 ml PBS, um die Probe zu waschen.
9. Zentrifuge wieder für 10 Minuten bei 514 xg ohne Bremse Zentrifuge.
10. Vorsichtig den Überstand verwerfen und wieder aussetzen das Pellet wie oben. Die Zellen sind, bereit für die Kryokonservierung (mit PBMC Kryokonservierung-Protokoll), die Stimulation oder Durchflusszytometrie Phänotypisierung.

4. CMC Oberflächenfärbung und Durchflusszytometrie

1. Das Pellet aus Schritt 3.10 in 100 ul Blockierungslösung und Transfer entweder in eine 96-Well-Platte oder FACS-Röhrchen. Die Blockierungslösung (Fc &ggr;-Rezeptoren zu blockieren) Rezeptur ist wie folgt: 1,8 ul Maus-IgG (Endkonzentration 0,2 &mgr; g / &mgr; l), 5 &mgr; l FBS und 93,2 &mgr; l FACS-Wasch (PBS + 2% FBS).Die Färbung kann in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden, wenn Pelletgrößen klein genug sind, müssen aber möglicherweise in FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn Pellets sind routinemäßig groß. Es ist wichtig, Antikörper entsprechend titrieren.
2. Blockieren Sie die Proben für 10 Minuten auf Eis / bei 4 ° C
3. Mit 100 &mgr; l FACS-Wash (PBS + 2% FBS) in 96-Well-Platten oder 500 &mgr; l FACS-Röhrchen in die Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C mit dem Brems auf niedrig (oder aus, wenn eine niedrige Brems Einstellung nicht verfügbar ist).
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet durch Bewegung. In Lebensfähigkeit Stain (Live Toten feststellbar Lebensfähigkeit Farbstoff). Vorbereitung Lebensfähigkeit Farbstoff nach den Anweisungen des Herstellers. Er muss dann für den Einsatz in jedem Labor / Durchflusszytometer Setup titriert werden. Inkubation für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C.
5. Waschen Sie die Zellen μl/500 100 ul PBS (für 96-Well-Platte / FACS-Röhrchen). Zentrifugieren bei 600 g für 10 min mit geringer / ohne Bremse. Entfernen supernatant und resuspendieren Zellen.
6. Inkubieren der Zellen mit der Mischung aus Oberflächenmarker-Antikörper in einem Gesamtvolumen von 100 ul. WICHTIG: Optimieren und titriert jedes Durchflusszytometrie Tafel vor der Färbung zu probieren. Zellen für 30 min im Dunkeln inkubieren bei 4 ° C.
7. Wiederholen Sie Schritt 4.5. wenn Anfärben in einer 96-Well-Platte, Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen und mit Wasser auf ein Endvolumen von 750 &mgr; l FACS-Wash mit 1% Paraformaldehyd (PFA) (oder Cytofix, verdünnt 1 in 4). Gehen Sie zur Datenerfassung auf einem Durchflusszytometer.

5. Entnahme und Vorbereitung von Gebärmutterhalskrebs Vaginal Lavage (CVL)

1. Vor der Entnahme Cytobrush, verwenden Sie eine Spritze, um die Endocervix mit 2 ml steriler PBS waschen und saugen Sie den Spülung aus dem hinteren Scheidengewölbe.
2. Sammeln Sie die angesaugte Spülung Probe in ein 15 ml Falcon-Röhrchen und halten auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung.
3. Zentrifuge Proben bei 400 × g für 7 min, um Zelltrümmer zu entfernen.
4. Collect der Überstand, Aliquot der Probe in 1 ml oder 500 ul Aliquots und bei -70 ° C Aliquots können ELISA-oder Perlen Array Analyse der CVL Proteine ​​aufgetaut werden, aber vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren / Auftauen.
5. Wenn gewünscht, das Pellet von Zelltrümmern in RNA später RNA-Expression durch folgende Protokoll des Herstellers gemessen.

6. Datenerfassung

1. Einen Satz der Vergütung Rohre, die den Antikörper-Panel passt. Führen Sie die Ausgleichsrohre spektrale Überlappung einzustellen. Führen Sie die Proben auf jedem Multicolor Durchflusszytometer, dass ist für den Fluorochrom konjugierte Antikörper in der Gruppe verwendet, konfiguriert.
2. Erwerben Sie eine Probe PBMC erste Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Spannung, um die Lymphozytenpopulation erkennen einzustellen. Versuchen, sie bei 100 auf jeder Achse auf einer linearen Skala zu halten. Ausführen eines PBMC Steuer wird es deutlich einfacher, die CMC Lymphozyten-Population zu finden.
3. Das FSC-Schwelle für die CMC-Proben müssen in Bezug auf PBMC-Proben wegen zu niedrigen Werten FSC schmieren die SSC-Achse erhöht werden.
4. Mischen Sie jedes Rohr vor dem Erwerb. Erwerben das gesamte Rohr, die Anzahl der Lymphozyten-Gate Ereignisse gesammelt maximieren. Überwachen Sie die Maschine sorgfältig, um ein Verstopfen zu vermeiden.
5. Exportieren der Daten in eine durchflusszytometrische Analyse Programm wie FlowJo.

7. Gating-Strategie

1. Wählen Sie Weiterleiten Seitenstreuung hoch (FSC-H) / Vorwärts Seitenstreubereich (FSC-A) die Singulett-Bevölkerung zu bestimmen.
2. Wählen Sie Zeit gegen Fluoreszierende Marker (wie zB FITC) für die Qualität der Akquisition steuern. Änderung der Strömungsrate kann zu Artefakten in den Daten einzuführen. Schließen Sie alle mögliche Fläche, die Diskrepanz in der Fließgeschwindigkeit zeigt.
3. Identifizieren Sie die Lymphozyten-Population auf SSC-A/FSC-A Handlung. Verwenden Sie einen PBMC Steuerung, um die Identifizierung zu erleichtern. Beachten Sie, dass die CMC Lymphozyten-Population vielleicht nicht so klar wie die PBMC Kontrolle.
4. Tor auf SSC-A/viability färben, um tote Zellen von lebenden Zellen auszuschließen. Tote Zellen können nicht-spezifisch zu integrieren, die Antikörper, die Artefakte vorstellen wird.
5. Tor auf der SSC-A/CD3, um die T-Zellpopulation zu identifizieren. Von diesem Tor, identifizieren die CD4 + und CD8 +-Populationen.

Ergebnisse

Multi Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Phänotypen und Funktionen der Zell-Untergruppen in bisher nicht charakterisiertes Gewebe zu sezieren. Analyse von CMC Proben können Informationen sowohl Lymphozyten und Monozyten-Populationen mit entsprechenden Gating Strategien ergeben.

Ein Vertreter CMC Gating-Strategie, im Vergleich zu einem angepassten PBMC-Profil, ist in Abbildung 2 dargestellt. Das FSC-A gegen FSC-H ermöglicht Grundstück für den...

Diskussion

Angesichts der großen Wissenslücken in Bezug auf die Immunität im weiblichen Genitaltrakt (FGT), können phänotypische Analyse von CMC eine breite Palette von Einsichten in verschiedene Lymphozyten-Populationen in den Gebärmutterhals zu liefern. Mit Proteomanalyse und Viruslastmessungen in den zervikalen Spülung gekoppelt, kann Immunität zu sexuell übertragbaren Infektionen (STI) s und andere Krankheitserreger in verschiedenen Populationen zerschnitten werden.

Technische Übe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant