Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Özet

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Özet

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Giriş

Yeni HIV enfeksiyonlarının çoğunluğu dünya çapında kadınların 2011 yılında (UNAIDS ¹⁾ yeni enfeksiyonların% 47 temsil ile, heteroseksüel iletim yoluyla ortaya çıkar. Kadın genital (FGT), HIV ve diğer cinsel yolla bulaşan patojenler için ana giriş portallarından birini anlamak, enfeksiyonu önlemek için etkili stratejiler bulmak için yolda yüksek önem taşımaktadır. Genital mukoza bağışıklık karşılıkları da açık bir şekilde benzersiz ve periferik kan ² ölçülen farklıdır. Ancak, FGT de bağışıklık dinamikleri mevcut bilgi en iyi sınırlıdır. Bugüne kadar, mukozal bağışıklık çevre çalışmaları büyük ölçüde enfeksiyonu takiben mukozal dokularda erken olaylar sonraki hastalığın ilerlemesi ^3,4 üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu açık hale gelmiştir gut-ilişkili lenfoid dokularda (GALT), odaklanmıştır. Genital mukoza numune toplama büyük bir sorun teşkil etmektedir ve lak için en azından kısmen sorumludurFGT ve immünoloji anlayış k. FGT bu yerel örnekler toplamak ve analiz etmek için etkili yöntemler gerektiren olan farklı çevre bağlamında ev sahibi ve patojen arasındaki bağışıklık dinamiğin bulmaca çözme.

FGT iki bölüme ayrılır: fallop tüpleri, endometrium ve endoserviksten ve ektoservikste içeren alt sistem ve vajina içeren üst üreme yolları (Kaushic tarafından gözden vd ^5). Bu farklı sitelerde nispi katkısı HIV enfeksiyonuna ne hala belirsiz olduğunu, ancak her iki site HIV girişi ⁶ katkı verebilecek düşünülmektedir. T hücreleri, makrofajlar (Rodriguez-Garcia et al yorumlanan ²⁾ yaklaşık 10% 'sini, üst ve alt üreme yolları olarak lökositlerin% 40-50 temsil eder. T hücreleri, vajina, rahim ve endometriyumda tespit edilebilir. Makrofajlar, daha güçlü olan localiher ikisi de dokularda tespit edilebilir, ancak, serviks daha endometriyum ve myometrial bağ dokusunda zed. Son olarak, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ve Langerhans hücreleri de FGT dokularda tespit edilebilir. Fenotip ve bağışıklık nüfus ve HIV enfeksiyonuna karşı duyarlılık oranları hormonal döngülerine göre önemlisi değişebilir, hormonal kontraseptifler, bakteriyel vajinozis veya cinsel faaliyetler ^5,7-9 kullanımı.

Çeşitli yöntemler FGT bağışıklık nüfus ve çalışma ortamı için geliştirilmiştir. Servikal biyopsi, servikal cytobrushes ve servikovaginal lavajlar (CVL) ^10-12 en sık literatürde genelinde kullanılmaktadır. PBS lavaj ile CVL toplama en kolay metodu olarak ve son derece düşük bir hücre verimle immün modülatör proteinlerin ancak sonuç çalışma sağlar ve bu nedenle FGT ^13'ün bağışıklık hücresi popülasyonlarının çalışmak için uygun değildir. CVL örnekleri, diğer taraftan, v olanELISA, sitokin boncuk dizi ¹⁴ ya da kütle spektrofotometresi ^15,16 gibi yöntemler kullanılarak, çeşitli sitokinler, kemokinler ya da antimikrobiyal faktörlerin ekspresyonunu ölçerek FGT bağışıklık çevre değerlendirmek için yararlı ery. Immün hücre frekansları, fenotipler ve işlevleri karakterizasyonu servikal cytobrush veya servikal biyopsi örnekleme ile servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplanması ile elde edilebilir.

Servikal biyopsi örnekleme kanama rahatsızlık ve riskini artırır ve kadının ¹² bağışıklık durumuna bağlı olarak prosedürü takip iyileşmek için 2 ila 11 gün sürer invaziv bir yöntemdir. Öte yandan, servikal cytobrushes toplandı, hücre alt verim rağmen FGT bağışık hücreleri toplamak için daha az invaziv ve daha uygun bir yöntemdir. Her iki yöntem de CD45 + lökositlerin aynı verimi ulaşabilir, ancak iki ardışık servikal cytobrushes ihtiva ettiği hücre aynı miktarda elde etmek için gerekli olan in bir biyopsi ^13. Bununla birlikte, ^{yine, 14} numune cytobrush akış sitometrisi ile daha da ex vivo feno hücre kabul edilebilir bir sayısı (yaklaşık 5000 CD45 + hücre / cytobrush) sağlamaktadır. Uyarılması ve hücre içi akış sitometrisi veya QPCR HIV spesifik immün tepkilerini ¹⁷ ya da hücre Th polarizasyonunu ¹⁸ tespit etmek cytobrush türevli CMC kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiş olarak aynı zamanda, fonksiyonel karakterizasyonu, bu numuneler üzerinde ifa edilebilir. T hücreleri nüfusunun genişleme aynı zamanda CMC lerin ¹⁹ ile işlevsel çalışmalar kolaylaştırabilir.

Bu biyopsiler ve cytobrushes FGT belirgin bölümlerini örnek olduğuna dikkat etmek önemlidir. Servikal cytobrushes endoserviksten ve muhtemelen transformasyon bölgesinin epitel türetilen hücrelerin toplanması, serviks örnek ise biyopsileri, ektoservikste ^12,13 epiteli ve stroma üstün kısmından türetilmiştir. Cytobrush örnekler bu nedenle yeniden örnekbiyopsiler, bir skuamöz tabakalı epitelyum ⁵ ile kaplı bir bölge dahil ederken gion, kolumnar epitel tek bir tabaka oluşur. Bunun bir sonucu olarak, servikal biyopsi ve cytobrush tarafından toplanan lökosit popülasyonları doğası farklıdır. Cytobrushes CD14 + monositler / makrofajlar ¹³ daha yüksek bir oranda bir araya gelmesinden ise Biyopsiler, CD3 + T hücrelerinin daha yüksek bir oran toplamak.

FGT immünolojisini incelenmesi uzun yıllar ^20-22 bir ilgi oldu ve biz cytobrush türetilmiş CMC çalışma ile uzmanlık büyük bir birikimi var. Bizim çalışmalar, HIV ile enfekte enfekte ve HIV-seronegatif maruz Nairobi, Kenya (HESN) kadın seks işçileri çalışma çoğunlukla odaklanmak. HIV tercihli olarak FGT HIV tarafından hedeflenebilir aktive edilmiş hücre ²³ ve daha düşük sayılar HIV satın karşı korunmasına katkıda bulunabilir, aktive edilmiş T hücrelerinde çoğaltır. Bu hipoteze göre, birkaç Studi doğrultusundaes henüz ^24,25 enfekte kalır ve bu hareketsiz fenotip de FGT ¹⁴ gözlenen yüksek HIV maruz HESN seks işçileri arasında düşük bağışıklık aktivasyonunu tarif var. Burada, işleme için bir yöntem tarif ve ex vivo akış sitometrisi ile servikal cytobrushes türetilen CMC örneklerde T hücrelerinin aktivasyonunun değerlendirilmesi.

Protokol

Etik deyimi: Manitoba Üniversitesi'nde ve Nairobi Kenyatta Ulusal Hastane / Üniversitesi'nin hem araştırma etik kurulları bu çalışmayı onayladı ve yazılı bilgilendirilmiş onam tüm katılımcıların elde edilmiştir.

1.. Medya hazırlanması ve CMC Toplama Tüpleri

1. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137,93 mM NaCl, 2.67 mM KCI, 8.1 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM KH ₂ PO ₄₎ hazırlayın. Kısırlık için Otoklav. Bu birkaç ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
2. Ön kısım 5 ml PBS içine 50 ml şahin tüp (tahsil edilecek numune başına bir) ve 4 º C'de mağaza örnek toplama zamanına kadar.
3. Depolama için lavaj toplamak için örnek başına 2-4 cryovials ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin.
4. Hücre kültürü ortamı hazırlayın: RPMI 1640 +% 1 penisilin / streptomisin / amfoterisin B (nihai konsantrasyon 100 birim / ml, 100 ug / ml ve 250 ng / ml, respectivFCS yok / FBS'li ely ekledi.

Cytobrush Numune 2. Koleksiyonu

Cytobrush örneklerinin toplanması eğitimli bir MD veya jinekolog tarafından yapılmalıdır non-invaziv bir işlemdir.

1. Bir cytobrush ve bir tahta veya plastik kazıyıcı ikisi kullanılarak servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplayın. (Şekil 1) sıyırıcıyı taktıktan ve servikal os etrafında dönen tarafından spekulum muayenesi altında katılımcıdan CMC'yi toplayın. , Endoservikal os içine cytobrush yerleştirin 360 ° döndürmek ve derhal 5 ml PBS içeren 50 ml şahin tüp içine cytobrush ve kazıyıcı hem yerleştirin.
2. Işleme kadar 4 º C / buz örnekleri tutun. Toplama 2 saat içinde hücre canlılığı, süreç örnekleri korumak için.
3. Mümkünse, periferik kan mononükleer hücre CMC analizi için bir karşılaştırma / kontrol olarak hizmet etmek (hücre) izolasyon için yeşil üst heparin vacutainers eşleşen kan örnekleri toplamak.

CMC 3. İzolasyonu

Çift eldiven ile steril bir biyogüvenlik kabini içinde, bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuarda örnek işleme gerçekleştirin.

1. Toplama sırasında, CMC örnekleri kan ile kirlenebilir. Nihai numunede PBMC'nin karıştırıcı dahil önlemek amacıyla çalışmadan görünür kan kirlenme örnekleri hariç. Nedeniyle CMC örneklerden izole edilen lenfositlerin düşük sayıda, küçük kan kontaminasyon kolayca CMC lenfosit bileşeni bunaltabilir.
2. Fırçalarından hücreleri ayırmak için 45 saniye boyunca cytobrush ve kazıyıcı hem de içeren Vortex şahin tüpler. Örnekler, bu işlem sırasında köpüklü hale gelebilir; Bu normaldir.
3. Kazıyıcı kapalı kalan malzemeyi kazımak ve bir çamaşır suyu çözeltisi içine kazıyıcı atmak için cytobrush kullanın. Fırça / kazıyıcı bağlı kalarak herhangi hücreleri toplamak için, başparmak ve işaret parmağı arasında kazıyıcı sıkmak taze bir eldiven kullanın.Hücreleri ve PBS aynı 50 ml tüp tahsil edilecek izin, fırçayı aşağı kaydırın. Bir çamaşır suyu çözeltisi içine cytobrush atmak ve eldiven atın.
   ÖNEMLİ: Her örnek için yeni bir eldiven kullanın.
4. Yeni bir 50 ml şahin tüp 100 mikron naylon hücre süzgeç yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, numune tüpten PBS-hücre süspansiyonu toplamak ve temiz bir tüp içine süzgeç içinden geçirilerek filtre edilmektedir.
5. Orijinal numune tüpüne RPMI 1640 içinde 5 ml. Transfer pipeti kullanarak, RPMI ile örnek tüpün tarafı yıkayın ve yeni bir toplama tüpüne filtreden aktarın. De RPMI ile naylon filtrenin alt yıkayın.
6. 514 x g de 10 dakika süre ile numuneler santrifüjleyin. Bu CMC pelet yerinden ayrılmasını önlemek amacıyla, bu aşama sırasında santrifüj fren bırakmak için çok önemlidir.
7. Yavaşça pelet rahatsız değil özen, tüpten çıkarın. Pelet boyutu son derece değişken olacaktır; öylesineDiğer durumlarda, topak zor görünür ve son derece şeffaf iken me örnekleri, topak nedeniyle epitel hücreleri çok sayıda varlığı oldukça büyüktür.
8. Falcon tüpün yumuşak çalkalama ile pelet yeniden süspanse edin. Örnek yıkamak için 5 ml PBS ekleyin.
9. Herhangi bir santrifüj freni ile 514 x g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj.
10. Dikkatlice süpernatant atın ve yukarıdaki gibi pelet yeniden askıya. Hücreleri (bir PBMC dondurulması protokolünü kullanarak) kriyokoruması, uyarma veya fenotiplen akış sitometri ya için hazırız.

4. CMC Yüzey Boyama ve Sitometrisi

1. 100 ml bloke etme ul aşama 3.10 gelen pelet yeniden süspanse edin ve 96 oyuklu bir plaka ya da FACS tüpü içine ya aktarın. Bloklama çözeltisi (Fcy reseptörleri bloke etmek için) aşağıdaki tarifi: 1.8 ul fare IgG (nihai konsantrasyon 0.2 mg / ml), 5 ul FBS ve 93,2 ul FACS yıkama (PBS +% 2 FBS).Boyama topak boyutları kadar küçük ise, 96 oyuklu bir plaka içerisinde gerçekleştirilebilir, ama granül rutin olarak büyük ise FACS tüpler içinde gerçekleştirilebilir gerekebilir. Bu, buna göre antikor titre etmek için önemlidir.
2. 4 ° C'de buz / 10 dakika boyunca numune bloke
3. 96 oyuklu plakalar içinde FACS yıkama (PBS +% 2 FBS), 100 ul, FACS ya da tüpler içinde 500 ul hücreleri yıkayın. Üzerinde düşük fren ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g santrifüj (kapalı veya düşük fren ayarı kullanılamaz ise).
4. Süpernatantı ve ajitasyon ile hücre pelet yeniden askıya. Canlılığı Leke (Canlı Ölü düzeltilebilir canlılığı boya) ekleyin. Üreticinin talimatlarına uygun olarak canlılığı boya hazırlayın. Her laboratuvar / sitometresiyle kurulumunda kullanılmak üzere titre gerekebilir. 4 ° C'de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe
5. (96 oyuklu plaka / FACS borular için) hücreleri PBS içinde 100 ul μl/500 yıkayın. Düşük / yok frenli 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Supernatan Kaldırt ve tekrar süspansiyon hücreleri.
6. 100 ul'lik bir toplam hacimde, yüzey işaretleyici antikor kokteyli ile hücreleri inkübe edin. ÖNEMLİ: Optimize ve boyanma örnek önce panelde sitometri her akışını titre. 4 ° C'de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri
7. Adımı 4.5 tekrarlayın. bir FACS tüpü 96 oyuklu bir plaka, transfer hücrelerde boyama ve% 1 paraformaldehid (PFA) içeren FACS yıkama 750 ul'lik nihai bir hacme kadar seyreltin (veya Cytofix 4, 1 'seyreltilmiş). Bir akış Sitometre üzerinde veri toplama devam edin.

5.. Toplama ve Servikal Vajinal Lavajın Hazırlama (CVL)

1. Örnekleme cytobrush önce, steril PBS içinde 2 ml endoserviksten yıkama ve posterior forniksten lavaj aspire için bir şırınga kullanın.
2. 15 ml şahin tüp içine aspire lavaj örnek toplamak ve işlenmesine kadar 4 º C / buz üzerinde tutmak.
3. Hücresel enkaz kaldırmak için 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj örnek.
4. Co-70 ° C'de 1 ml ya da 500 ul alikotları ve deposuna süpernatan, kısım örnek llect Alikolar ELISA veya CVL proteinlerin boncuk dizisi analizi için çözülmüş, ancak birden donma / çözülme döngüleri önlemek olabilir.
5. Eğer arzu edilirse, üreticinin protokolü izlenerek RNA ekspresyonunu ölçmek için daha sonra RNA hücresel enkaz pelletini.

6.. Veri Toplama

1. Antikor paneli maçlar tazminat tüpler bir dizi hazırlamak. Spektral örtüşme ayarlamak için tazminat tüpler çalıştırın. Bu sitometresi renkli bir akış örnekleri çalıştırın panelde kullanılan florokrom eşlenik antikorlar için yapılandırılır.
2. Lenfosit nüfusu tespit etmek için İleri Dağılım'ı (FSC) ve yan dağılım (SSC) voltaj ayarlamak için ilk PBMC'nin örnek edinin. Lineer ölçekte her bir eksen üzerinde 100 onları tutmaya çalışın. Bir PBMC denetimi Koşu önemli ölçüde daha kolay CMC lenfosit nüfusu bulmak için yapacaktır.
3. CMC numuneler için FSC eşik düşük FSC değerlerinde SSC eksenini smear nedeniyle PBMC'nin numunelere göre artmış gerekebilir.
4. Almadan önce her tüp vorteks. Toplanan lenfosit kapısı olayların sayısını arttırmak için bütün boruyu edinin. Tıkanmasını önlemek için dikkatli makineyi izleyin.
5. Böyle FlowJo gibi bir akım sitometri analizi programına İhracat verileri.

7. Yolluk Stratejisi

1. Yüksek İleri yan dağılım (FSC-H) seçin / İleri yan dağılım alanı (FSC-A) tekli nüfusu belirlemek için.
2. Edinimi kalitesi kontrol etmek için (örnek olarak FITC) Floresan işaretleyici karşı Saat'i seçin. Akış hızı değişim verilerde eserler taşıyabilirler. Akış hızında farklılık gösteren herhangi bir alan kapsar.
3. SSC-A/FSC-A arsa üzerinde lenfosit popülasyonu tespit. Kimlik kolaylaştırmak için bir PBMC'nin kontrolünü kullanın. CMC lenfosit nüfus PBMC kontrolü gibi net olmayabilir unutmayın.
4. SSC-A/viability üzerinde Kapısı canlı hücreler ölü hücreleri hariç boya. Ölü hücreler non-spesifik eserler tanıtacak olan antikorları dahil edebilirsiniz.
5. SSC-A/CD3 üzerinde kapı T hücre popülasyonu tespit etmek. Bu kapıdan, CD4 + ve CD8 + popülasyonlarının belirlenmesi.

Sonuçlar

Multiparametreli akış sitometri önce karakterize dokularda hücre alt fenotipleri ve fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araçtır. CMC örneklerinin analizi, uygun yolluk stratejileri ile lenfosit ve monosit nüfus hem de bilgi verebilir.

Temsili bir CMC yolluk bir strateji, bir eşleştirilmiş PBMC profili ile karşılaştırıldığında, Şekil 2 'de gösterilmiştir. FSC-H grafiği FSC-A daha sonra filtrasyon, PBMC ile karşılaştırıldığında CMC...

Tartışmalar

Kadın genital sistem (FGT) de dokunulmazlık ile ilgili bilgide büyük boşluklar göz önüne alındığında, CMC fenotipik analizi serviks birden fazla lenfosit nüfus içine anlayışlar geniş bir dizi sağlayabilir. Proteomik analizi ve servikal lavajında ​​viral yük ölçümleri ile birleştiğinde, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar (CYBE) ler ve diğer patojenler için bağışıklık çeşitli toplumlarda disseke edilebilir.

Teknik hususlar - CMCs: izolasy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant