Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano

Riepilogo

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Abstract

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introduzione

La maggior parte delle nuove infezioni da HIV in tutto il mondo nascono attraverso la trasmissione eterosessuale, con le donne rappresentano il 47% delle nuove infezioni nel 2011 (UNAIDS ^1). Comprendere il tratto genitale femminile (FGT), uno dei principali portali di ingresso per l'HIV e di altri agenti patogeni a trasmissione sessuale, è di grande importanza nel cammino per trovare strategie efficaci per prevenire l'infezione. Risposte immunitarie alla mucosa genitale sono chiaramente unico e differiscono da quelli misurati nel sangue periferico ^2. Tuttavia, l'attuale conoscenza delle dinamiche immunodeficienza al FGT è limitata al meglio. Ad oggi, gli studi di ambiente immunitario della mucosa hanno in gran parte concentrata sui tessuti linfoidi dell'intestino associato (GALT), dove è diventato chiaro che i primi eventi nei tessuti della mucosa seguenti infezioni hanno un forte impatto sulla successiva progressione della malattia ^3,4. Raccolta dei campioni dalla mucosa genitale rappresenta una grande sfida ed è almeno parzialmente responsabile del lack di comprensione della immunologia del FGT. Risolvere il puzzle della dinamica immunitario tra ospite e patogeno nel contesto dell'ambiente distinto che è il FGT richiede metodi efficienti per raccogliere e analizzare campioni di questo locale.

Il FGT è divisa in due sezioni: il tratto riproduttivo superiore che comprende le tube di Falloppio, endometrio e endocervice, e il tratto inferiore che contiene la portio e la vagina (recensito da Kaushic et al ^5). Non è ancora chiaro quanto il contributo relativo di questi diversi siti è all'HIV, ma si ritiene che entrambi i siti possono contribuire a voce HIV ^6. Cellule T rappresentano il 40-50% dei leucociti nei tratti riproduttivi superiori e inferiori, mentre macrofagi costituiscono circa il 10% (recensito in Rodriguez-Garcia et al ^2). Cellule T possono essere rilevati nella vagina, cervice e dell'endometrio. I macrofagi sono più fortemente Localized nell'endometrio e tessuto connettivo miometrio rispetto alla cervice, anche se possono essere rilevati in entrambi i tessuti. Infine, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) e cellule di Langerhans possono essere rilevati anche nei tessuti FGT. Il fenotipo e proporzioni delle popolazioni immunitarie e la loro suscettibilità alle infezioni da HIV possono variare importante secondo cicli ormonali, l'uso di contraccettivi ormonali, vaginosi batterica o attività sessuali ^5,7-9.

Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare le popolazioni immunitarie e l'ambiente del FGT. Biopsia cervicale, cytobrushes cervicale e lavaggi cervico-vaginale (CVL), ^10-12 sono i più comunemente utilizzato in tutto il letteratura. Collezione CVL da PBS lavanda è il metodo più semplice e permette lo studio delle proteine ​​modulatori immunitari, ma i risultati del rendimento delle cellule estremamente basso, e quindi non è adatto per studiare le popolazioni di cellule immunitarie del FGT ^13. Campioni CVL sono, invece, very utili per valutare l'ambiente immunitario del FGT misurando l'espressione di diverse citochine, chemochine o fattori antimicrobici usando metodi quali ELISA, citochine branello matrice ¹⁴ o spettrometria di massa ^15,16. Caratterizzazione delle frequenze di cellule immunitarie, fenotipi e funzioni può essere ottenuto mediante prelievo di cellule mononucleate cervicali (CMC) da cytobrush cervicale o mediante campionamento biopsia cervicale.

Campionamento biopsia cervicale è un metodo invasivo che aumenta il disagio e rischio di sanguinamento e richiede 2 a 11 giorni per guarire seguendo la procedura a seconda dello stato immunitario della donna ^12. D'altra parte, cytobrushes cervicali, nonostante la minore resa di cellule raccolte, è un metodo meno invasivo e più conveniente per raccogliere le cellule immunitarie dal FGT. Entrambi i metodi possono raggiungere la stessa resa di leucociti CD45 +, ma due cytobrushes cervicali sequenziali sono necessari per avere la stessa quantità di cellule contenute in una biopsia ^13. Tuttavia, il campionamento cytobrush fornisce ancora un numero accettabile di cellule (cellule + circa 5.000 CD45 / cytobrush) per ulteriore ex vivo fenotipizzazione mediante citometria di flusso ^14. Inoltre, la caratterizzazione funzionale può essere effettuata su questi campioni, la stimolazione e flusso intracellulare citometria o qPCR sono state effettuate utilizzando CMC cytobrush derivate per identificare HIV-specifiche risposte immunitarie ¹⁷ o polarizzazione cellulare Th ^18. L'espansione della popolazione di cellule T può anche facilitare gli studi funzionali con CMC ^19.

È importante notare che le biopsie e cytobrushes campionare porzioni distinte della FGT. Biopsie sono derivati ​​dalla porzione superiore del epitelio e stroma della portio ^12,13, mentre cytobrushes cervicali campionare della cervice, raccogliendo cellule derivate dall'epitelio di endocervice e presumibilmente la zona di trasformazione. Campioni Cytobrush quindi degustare un regione composto da un unico strato di epitelio colonnare, mentre biopsie, comprendono una regione rivestita da un epitelio squamoso stratificato ^5. Di conseguenza, la natura delle popolazioni di leucociti raccolti da biopsia cervicale e cytobrush differisce. Biopsie raccolgono una percentuale maggiore di cellule T CD3 +, mentre cytobrushes comportano la raccolta di una maggiore percentuale di monociti CD14 + / macrofagi ^13.

Studiare la immunologia della FGT è stato un interesse per molti anni ^20-22 e abbiamo accumulato una grande esperienza con lo studio della CMC cytobrush-derivati. I nostri studi si concentrano principalmente sullo studio del virus HIV-infetti, non infetto e HIV-esposti sieronegativi (HESN) i lavoratori di sesso femminile da Nairobi, Kenya. HIV si replica preferenzialmente nelle cellule T attivate ²³ e inferiore numero di cellule attivate che possono essere avviati da HIV nel FGT potrebbero contribuire alla protezione contro l'acquisizione HIV. In linea con questa ipotesi, diversi studies hanno descritto attivazione immunitaria più bassa tra i lavoratori di sesso HESN che sono altamente esposti al virus HIV ancora rimanere infetto ^24,25, e questo fenotipo quiescente si osserva anche nel FGT ^14. Qui, descriviamo la metodologia per l'elaborazione e la valutazione cellule T di attivazione nei campioni CMC derivati ​​da cytobrushes cervicali da ex vivo citometria a flusso.

Protocollo

Dichiarazione etica: la ricerca etica consigli di amministrazione di entrambe dell'Università di Manitoba e Kenyatta Nazionale Ospedale / Università di Nairobi ha approvato questo studio e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio.

1. Preparazione dei Media e CMC Collection Tubes

1. Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8.1 mM Na ₂ HPO _4, 1.47 mM KH ₂ PO _4). Autoclave per la sterilità. Questo può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi.
2. Pre-aliquota 5 ml di soluzione in 50 ml di tubo falcon (uno per campione da raccogliere) e conservare a 4 ° C fino al momento di raccolta del campione.
3. Etichettare 2-4 cryovials o provette da 1,5 ml microcentrifuga per campione per raccogliere la lavanda per la conservazione.
4. Preparare cellule di coltura: RPMI 1640 + 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina B (concentrazione finale 100 unità / ml, 100 pg / ml e 250 ng / ml, respectively, senza FCS / FBS aggiunto.

2. Insieme di Cytobrush Campioni

Raccolta di campioni cytobrush è una procedura non invasiva che deve essere eseguita da un MD o ginecologo esperto.

1. Raccogliere le cellule mononucleate del collo dell'utero (CMC) utilizzando sia un cytobrush e un raschietto di legno o di plastica. Raccogliere CMC dal partecipante in esame speculum inserendo il raschietto e ruotando attorno al canale cervicale (Figura 1). Inserire il cytobrush nell'OS endocervicale, ruotare di 360 °, e collocare immediatamente sia il cytobrush e raschietto nel tubo falcon da 50 ml contenente 5 ml di PBS.
2. Conservare i campioni in ghiaccio / a 4 ° C fino al trattamento. Per mantenere la vitalità cellulare, campioni di processo entro 2 ore dal prelievo.
3. Se possibile, raccogliere campioni di sangue compensate in vacutainer eparina top verde di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento per servire come un comparatore / controllo per l'analisi CMC.

3. Isolamento di CMC

Eseguire l'elaborazione del campione in un laboratorio di biosicurezza di livello 2, in un armadio biosicurezza sterile con doppi guanti.

1. Durante la raccolta, i campioni CMC possono diventare contaminati con sangue. Escludere campioni con contaminazione sangue visibile dallo studio per evitare confusione inclusione di PBMC nel campione finale. A causa del basso numero di linfociti isolati da campioni CMC, la contaminazione del sangue minore può facilmente sopraffare il componente linfociti CMC.
2. Tubi Vortex falco contenenti sia il cytobrush e raschietto per 45 secondi di dissociare le cellule dalle spazzole. I campioni possono diventare spumosa durante questo processo; questo è normale.
3. Utilizzare il cytobrush per raschiare tutto il materiale residuo fuori il raschietto, e scartare il raschietto in una soluzione di candeggina. Per raccogliere le eventuali cellule rimanendo attaccati alla spazzola / raschietto, usare un guanto fresco per spremere il raschietto tra il pollice e l'indice.Scivolare giù il pennello, permettendo alle cellule e PBS da rilevare nella stessa provetta 50 ml. Eliminare il cytobrush in una soluzione di candeggina, e gettare il guanto.
   IMPORTANTE: utilizzare un nuovo guanto per ogni campione.
4. Montare un 100 micron filtro cella nylon a un nuovo 50 ml tubo falcon. Usando una pipetta di trasferimento, raccogliere la sospensione PBS-cella dal tubo campione e filtrare attraverso il filtro nel tubo fresco.
5. Aggiungere 5 ml di RPMI 1640 alla provetta campione originale. Utilizzando la pipetta di trasferimento, lavare i lati del tubo campione con il RPMI e le trasferisce attraverso il filtro per il nuovo tubo di raccolta. Lavare la parte inferiore del filtro di nylon con il RPMI pure.
6. Centrifugare i campioni per 10 min a 514 x g. E 'fondamentale per liberare il freno centrifuga durante questa fase, al fine di evitare stacchi del pellet CMC.
7. Rimuovere delicatamente il surnatante dal tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Dimensione pellet sarà molto variabile; in modome campioni, il pellet è abbastanza grande per la presenza di un gran numero di cellule epiteliali, mentre in altri casi, il pellet è appena visibile ed altamente trasparente.
8. Risospendere il pellet da lieve agitazione del tubo falco. Aggiungere 5 ml di PBS per lavare il campione.
9. Centrifuga nuovamente per 10 min a 514 xg senza freno centrifuga.
10. Eliminare attentamente il supernatante e risospendere il pellet come sopra. Le cellule sono pronte sia per la crioconservazione (utilizzando un protocollo di crioconservazione PBMC), la stimolazione o citometria a flusso fenotipizzazione.

4. CMC colorazione superficiale e Citometria a Flusso

1. Risospendere il pellet dal punto 3.10 in 100 ml di soluzione bloccante e trasferire sia in una piastra a 96 pozzetti o il tubo FACS. La soluzione bloccante (per bloccare i recettori Fcy) ricetta è la seguente: IgG murine 1,8 ml (concentrazione finale 0,2 mg / mL), 5 microlitri FBS e 93,2 microlitri FACS lavaggio (PBS +2% FBS).La colorazione può essere eseguita in una piastra a 96 se formati pellet sono abbastanza piccole, ma può avere bisogno di essere eseguita in tubi FACS se pellets sono ordinariamente grande. E 'importante per titolare anticorpi conseguenza.
2. Bloccare i campioni per 10 min in ghiaccio / a 4 ° C.
3. Lavare le cellule con 100 ml di FACS lavaggio (PBS 2% FBS) in piastre a 96 pozzetti, o 500 ml in tubi FACS. Centrifugare a 600 xg per 10 min a 4 ° C con il freno a basso (o fuori, se una regolazione del freno basso non è disponibile).
4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare mediante agitazione. Aggiungi vitalità Stain (Live Morto risolvibile vitalità colorante). Preparare la redditività colorante secondo le istruzioni del produttore. Potrebbe essere necessario titolato per l'uso in ogni impostazione del laboratorio / citometro. Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C.
5. Lavare le cellule μl/500 100 ml di PBS (per i tubi targa / FACS 96 pozzetti). Centrifugare a 600 xg per 10 min a basso / senza freno. Rimuovere supernatant e risospendere le cellule.
6. Incubare le cellule con il cocktail di anticorpi marcatori di superficie, in un volume totale di 100 microlitri. IMPORTANTE: Ottimizzare e titolare ogni citometria a flusso pannello prima di assaggiare colorazione. Incubare le cellule per 30 minuti al buio a 4 ° C.
7. Ripetere passo 4.5. Se la colorazione in una piastra da 96 pozzetti, le cellule di trasferimento ad un tubo FACS e portare a un volume finale di 750 ml di FACS lavaggio contenente 1% paraformaldeide (PFA) (o CytoFix, diluito 1 a 4). Procedere all'acquisizione dati su un citometro a flusso.

5. Raccolta e preparazione del collo dell'utero vaginale del lavaggio (CVL)

1. Prima cytobrush campionamento, utilizzare una siringa per lavare il endocervice con 2 ml di PBS sterile e aspirare il lavaggio del fornice posteriore.
2. Raccogliere il campione di lavaggio aspirato in un tubo da 15 ml falco e tenere in ghiaccio / a 4 ° C fino al trattamento.
3. Campione centrifugare a 400 xg per 7 minuti per rimuovere detriti cellulari.
4. Collect il surnatante, un'aliquota del campione in 1 ml o 500 microlitri aliquote e conservare a -70 ° C. Aliquote possono essere scongelati per l'ELISA o l'analisi di matrice cordone di proteine ​​CVL, ma evitano cicli multipli di congelamento / scongelamento.
5. Se lo si desidera, risospendere il pellet di RNA detriti cellulari in seguito a misurare l'espressione di RNA seguendo il protocollo del produttore.

6. Acquisizione Dati

1. Preparare una serie di tubi di compensazione che corrisponde al pannello di anticorpi. Eseguire i tubi di compensazione per regolare sovrapposizione spettrale. Eseguire i campioni su una qualsiasi flusso multicolore citometro che è configurato per gli anticorpi coniugati con fluorocromi utilizzati nel pannello.
2. Acquisire un campione PBMC prima di regolare Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) della tensione, al fine di rilevare la popolazione linfocitaria. Cercate di tenerli a 100 su ciascun asse su una scala lineare. Esecuzione di un controllo PBMC renderà molto più facile trovare la popolazione linfocitaria CMC.
3. La soglia FSC per campioni CMC può essere necessario aumentare rispetto ai campioni di PBMC causa spalmare fino all'asse SSC a bassi valori FSC.
4. Agitare ogni provetta prima di acquistare. Acquisire l'intero tubo per massimizzare il numero di eventi cancello linfociti raccolti. Monitorare attentamente la macchina per evitare intasamenti.
5. Esportare i dati in un programma di analisi di citometria a flusso, come FlowJo.

7. Strategia di gating

1. Selezionare Forward scatter lato alto (FSC-H) / Forward Area side scatter (FSC-A) per determinare la popolazione singoletto.
2. Selezionare Ora contro marcatore fluorescente (come ad esempio FITC) per controllare la qualità di acquisizione. Variazione della portata può introdurre artefatti nei dati. Escludere qualsiasi area che mostra discrepanza nei portata.
3. Identificare la popolazione linfocitaria su SSC-A/FSC-A trama. Utilizzare un controllo PBMC per facilitare l'identificazione. Si noti che la popolazione linfocitaria CMC potrebbe non essere chiaro come il controllo PBMC.
4. Gate SSC-A/viability tintura di escludere le cellule morte da cellule vive. Le cellule morte possono non specificamente incorporare gli anticorpi, che introdurrà artefatti.
5. Porta sul SSC-A/CD3 per identificare la popolazione di cellule T. Da questa porta, individuare le popolazioni CD4 + e CD8 +.

Risultati

Flusso multiparametrica citometria è un potente strumento per analizzare i fenotipi e le funzioni dei sottoinsiemi di cellule in tessuti precedentemente non caratterizzati. Analisi dei campioni CMC può dare informazioni sia su linfociti e monociti popolazioni con le strategie di gating adeguate.

Un rappresentante CMC strategia gating, rispetto ad un profilo PBMC abbinato, è mostrato in Figura 2. L'FSC-A piuttosto FSC-H trama consente l'esclusione di doppietti cell...

Discussione

Date le grandi lacune nella conoscenza per quanto riguarda l'immunità al tratto genitale femminile (FGT), analisi fenotipica di CMC in grado di fornire una vasta gamma di intuizioni più popolazioni linfocitarie alla cervice. Accoppiato con l'analisi proteomica e le misurazioni della carica virale di lavanda cervicale, l'immunità alle infezioni sessualmente trasmissibili (IST) s ed altri agenti patogeni può essere sezionato in varie popolazioni.

Considerazioni tecniche...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant