人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

要約

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

要約

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

概要

世界中の新たなHIV感染の大半は（UNAIDS ^1）2011年に新たな感染の47％に相当女性と、異性間感染によって起こる。女性の生殖器（FGT）、HIVやその他の性感染性病原体のメインエントリポータルの1を理解すること、感染症を予防するための効率的な戦略を見つけることへのパスに非常に重要である。性器粘膜での免疫応答は、明らかに固有のものであり、末梢血²で測定されたものとは異なる。しかし、FGTの免疫動態の現在の知識は、最高の状態で制限されています。現在までに、粘膜免疫環境の研究は、主としてそれが感染後に粘膜組織における初期事象は、その後の疾患の進行^3,4に強い影響を有することが明らかとなった腸管関連リンパ組織（GALT）に焦点を当ててきた。性器粘膜からサンプルを収集することは大きな課題であるとLACのために少なくとも部分的に責任があるFGTの免疫学の理解のK。 FGTはこのロケールからサンプルを収集し、分析するための効率的な方法が必要とされている特定の環境のコンテキストでのホストと病原体との間に免疫のダイナミックのパズルを解く。

FGTは2つのセクションに分かれています卵管、子宮内膜および子宮頚内膜が含まれ、上部生殖管および子宮膣部が含まれている下気道と膣（Kaushicによって審査ら ^5）。これは、これらの異なる部位の相対的寄与はHIV感染症であるものはまだ不明であるが、両方の部位がHIVエントリー⁶に寄与し得ると考えられている。マクロファージ（ロドリゲス·ガルシアら ²に概説されている）約10％を構成しながら、T細胞は、上部および下部生殖管における白血球の40〜50％を表す。 T細胞は、膣、子宮頚部、および子宮内膜中で検出することができる。マクロファージはより強くlocaliですそれらが両方の組織で検出することができるが、子宮内膜および子宮頸部より子宮筋層の結合組織にゼット。最後に、形質細胞様樹状細胞（pDC）およびランゲルハンス細胞もFGT組織において検出することができる。表現型および免疫人口やHIV感染に対する感受性の割合がホルモンサイクルに応じて重要なのは異なる場合があり、ホルモン避妊薬、細菌性膣炎や性的活動^5,7-9の使用。

多様な方法がFGTの免疫集団と環境を研究するために開発されてきた。子宮頸部生検、子宮頸cytobrushesと頸膣洗浄液^{（CVL）10月12日は、}最も一般的に文献全体で使用されています。 PBSの洗浄によるCVLコレクションは、最も簡単な方法であり、極めて低い細胞収量の免疫調節タンパク質が、結果の研究を可能にするため、FGT ¹³の免疫細胞集団を研究するためには適していない。 CVLサンプルは、一方で、νある例えば、ELISA、サイトカインビーズアレイ^{14 15,16}または質量分析などの方法を用いて種々のサイトカイン、ケモカインまたは抗菌因子の発現を測定することにより、FGTの免疫環境を評価するのに有用ERY。免疫細胞の頻度、表現型および機能の特徴付けは、子宮頸部細胞採取用ブラシによって、または子宮頸部生検サンプリングによって子宮頸部単核細胞（CMC）を収集することによって達成することができる。

子宮頸部生検標本は、出血の不快感や危険性を高めると女¹²の免疫状態に応じて、手順に従って癒すために2から11日かかる侵襲的な方法である。一方、子宮頸cytobrushesは、採取した細胞のより低い利回りにもかかわらず、FGTから免疫細胞を収集するための低侵襲、より便利な方法である。両方の方法は、CD45 +白血球の同じ収率に達することができるが、二つの連続子宮頸部cytobrushesが含まれる細胞と同じ量を得るために必要であるiをN 1の生検^13。それにもかかわらず、細胞採取用ブラシのサンプリングは、まだ¹⁴フローサイトメトリーによるさらなるex vivoでの表現型解析のための細胞の許容数（約5000 CD45 +細胞/細胞採取用ブラシ）を提供します。刺激および細胞内フローサイトメトリーまたは定量PCRは、HIV特異的免疫応答¹⁷又はTh細胞の分極^18を識別するために^、細胞採取用ブラシ由来のCMCを使用して実施されているように、また、機能的な特徴付けは、これらの試料上で行うことができる。 T細胞集団の拡大はまた、CMCを¹⁹と機能的研究を容易にすることができる。

それは、生検およびcytobrushesはFGTの異なる部分をサンプリングしていることに注意することが重要である。子宮頸cytobrushesは子宮頸部、おそらく移行帯の上皮由来の細胞を集め、子宮口をサンプリングしながら、生検、子宮膣部^12,13の上皮と間質の優れた部分に由来している。細胞採取用ブラシのサンプルは、そのための再サンプリング生検は、扁平重層上皮⁵によって裏打ち領域を含み、一方祇園は、円柱上皮の単層からなる。その結果、子宮頸部生検および細胞採取用ブラシによって収集白血球集団の性質が異なっている。 cytobrushesは、CD14 +単球/マクロファージ¹³の割合が高くのコレクションになるのに対し、生検では、CD3 + T細胞の割合が高く集める。

FGTの免疫学を研究することは、長年にわたって^20〜22関心されており、我々は細胞採取用ブラシ由来のCMCの研究と専門知識の多くを蓄積してきました。我々の研究は、ケニアのナイロビからのHIVに感染し、感染していないと、HIV-曝露反応陰性（HESN）女性セックスワーカーの研究に主に焦点を当てています。 HIVは優先的にFGTでHIVの標的とすることができる活性化された細胞の²³と下部の数字は、HIVの獲得に対する保護に貢献できる活性化したT細胞で複製。この仮説に沿って、いくつかのストゥディESは非常にHIVにさらされているHESNのセックスワーカーの免疫活性化は、まだ感染していない^24,25まま下に記載されており、この静止表現型はまた、FGT ¹⁴で観察される。ここでは、処理のための方法論を記載し、ex vivoでフローサイトメトリーによって子宮頸部cytobrushes由来CMCサンプル中のT細胞の活性化を評価する。

プロトコル

倫理声明：マニトバ大学、ナイロビのケニヤッタ国立病院/大学の両方の研究倫理ボードは、この研究を承認し、書面によるインフォームドコンセントは、すべての研究参加者から得た。

1。メディアの作成およびCMCコレクションチューブ

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137.93のNaCl、2.67 mMの塩化カリウム、8.1ミリモルのNa ₂ HPO _4、1.47 mMのKH ₂ PO _4）を調製する。無菌性のためのオートクレーブ。これは、数ヶ月間、4℃で保存することができる。
2. 事前に分量5ミリリットルのPBS 4ºCで50ミリリットルファルコンチューブ（サンプルあたり1を収集するため）、ストアにサンプル採取時まで。
3. ストレージ用洗浄液を収集するために、サンプルあたり2-4凍結バイアルまたは1.5 mlマイクロチューブにラベルを付けます。
4. 細胞培養培地を調製する：RPMI 1640 + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB（終濃度100単位/ ml、100μg/ mlの250 ng / mlで、respectivイーリー、無FCSを/ FBSを追加しました。

細胞採取用ブラシのサンプルの2。コレクション

細胞採取用ブラシサンプルの採取は、訓練されたMDや婦人科医によって行われなければならない非侵襲的な処置である。

1. 細胞採取用ブラシ、木製やプラスチック製のスクレーパーの両方を使用して子宮頸核細胞（CMC）を収集します。 （ 図1）スクレーパーを挿入し、子宮口の周りに回転させることによって、膣鏡検査中の参加者から、CMCを収集します。 、子宮頸管OSに細胞採取用ブラシを挿入して360°回転し、すぐに5mlのPBSを含む50ミリリットルファルコンチューブに細胞採取用ブラシとスクレーパーの両方を置く。
2. 処理まで4℃で氷/上のサンプルを保管してください。採取後2時間以内に細胞生存率は、処理のサンプルを維持する。
3. 可能な場合は、末梢血単核細胞CMC分析のための比較器/制御として機能する（PBMC）を単離するためのグリーントップヘパリンバキュテナー内の一致した血液サンプルを採取。

CMCで3。分離

二重の手袋で、無菌バイオセーフティキャビネット内で、バイオセーフティーレベル2実験室でサンプル処理を実行します。

1. 収集中に、CMC試料としては、血液で汚染になることができます。最終的なサンプル中のPBMCの交絡混入を防止するために、調査から見える血液汚染を有するサンプルを除外します。により、CMC試料から単離したリンパ球の数が少ないと、マイナー血液汚染を簡単に、CMCリンパコンポーネントを圧倒することができます。
2. ブラシから細胞を解離させるために45秒間細胞採取用ブラシとスクレーパーの両方を含む渦ファルコンチューブ。サンプルは、このプロセスの間に、泡状になることがあり;これは正常です。
3. スクレーパーオフ任意の残りの材料をこすり、及び漂白液にスクレーパーを廃棄するように細胞採取用ブラシを使用しています。ブラシ/スクレーパーに付着したまま任意の細胞を収集するには、親指と人差し指の間にスクレーパーを圧迫する新鮮な手袋を使用しています。セルおよびPBSを同じ50mlチューブに収集することができるように、ブラシを下にスライドさせます。漂白剤溶液に細胞採取用ブラシを破棄し、手袋を破棄。
   重要：各サンプルのために新しい手袋を使用してください。
4. 新しい50mlファルコンチューブに100μmのナイロン細胞ストレーナーを取り付けます。トランスファーピペットを用いて、サンプルチューブからPBS-細胞懸濁液を回収し、新鮮なチューブにストレーナーを通して濾過する。
5. オリジナルのサンプルチューブに、RPMI 1640の5ミリリットルを追加します。トランスファーピペットを用いて、RPMIで試料管の側面を洗浄し、新しい収集管にフィルターを介して移す。だけでなく、RPMIでナイロンフィルターの底部を洗浄します。
6. 遠心分離機514 x gで10分間サンプル。これは、CMCペレットの脱落を防止するために、このステップの間に遠心ブレーキを切ったままにすることが重要である。
7. 優しくペレットを乱さないように注意しながら、チューブから上清を除去。ペレットサイズは​​非常に変化になります。その中で他の場合には、ペレットはほとんど見えかつ高度に透明である間、私試料ペレットを、上皮細胞の多数の存在に起因する非常に大きい。
8. ファルコンチューブを穏やかに攪拌することによりペレットを再懸濁。サンプルを洗浄するために、PBSの5ミリリットルを追加します。
9. 無遠心ブレーキを514×gで10分間、再び遠心分離します。
10. 慎重に上清を廃棄し、上記のようにペレットを再懸濁。細胞（PBMCの凍結保存プロトコルを使用して）凍結保存、刺激または表現型フローサイトメトリーのどちらかの準備ができている。

4。のCMC表面染色およびフローサイトメトリー

1. ブロッキング溶液100μl中、ステップ3.10からペレットを再懸濁し、96ウェルプレートまたはFACSチューブに移すのいずれか。ブロッキング溶液（Fcγ受容体をブロックするには）次のようにレシピがある：1.8μlのマウスIgG（最終濃度0.2μgの/μL）、5μlのFBSおよび93.2μlのFACS洗浄（PBS +2％FBS）。染色は、ペレットの大きさが十分に小さい場合には、96ウェルプレートで行うことができるが、ペレットが日常的に大きい場合FACSチューブ中で行われる必要があり得る。それに応じて、抗体を滴定することが重要です。
2. 4℃にて/氷上で10分間サンプルをブロック
3. FACSチューブに96ウェルプレート、または500μlのFACSウォッシュ（PBS +2％FBS）100μlで細胞を洗浄。低オンブレーキと4℃で10分間600×gで遠心分離（またはオフ、ローブレーキの設定が利用できない場合）。
4. 上清を除去し、攪拌により細胞ペレットを再懸濁。生存能力染色（ライブデッド固定可能な実行可能性染料）を追加します。製造業者の指示に従って生存色素を調製する。これは、各研究室/サイトメーターのセットアップで使用するために滴定する必要があるかもしれません。 4℃の暗所で30分間インキュベート
5. （96ウェルプレート/ FACSチューブ用）細胞をPBSで100μl/500μLを洗ってください。低/ブレーキなしで10分間600×gで遠心分離する。 supernatanを削除T再懸濁細胞。
6. 総容量100μlで、表面マーカー抗体のカクテルで細胞をインキュベートする。重要：以前のサンプル染色を各フローサイトメトリーパネルを最適化し、滴定する。 4℃の暗所で30分間、細胞をインキュベート
7. ステップ4.5を繰り返します。 FACSチューブに、96ウェルプレートに転送細胞を染色する場合、1％パラホルムアルデヒド（PFA）を含有するFACSウォッシュ750μlの最終体積に希釈する（またはのCytofixを、4分の1に希釈）。フローサイトメーターでのデータ収集に進みます。

5。収集と子宮頸部膣肺胞洗浄液の調製（CVL）

1. サンプリングを細胞採取用ブラシの前に、滅菌PBS 2mlで子宮頚内膜を洗浄し、円蓋から洗浄液を吸引するために注射器を使用しています。
2. 15ミリリットルファルコンチューブに吸引洗浄サンプルを収集し、処理するまで4℃で氷/続ける。
3. 細胞破片を除去するために7分間400×gで遠心分離サンプル。
4. CO上澄み、1ミリリットルまたは500μlのアリコートに分量のサンプルを、-70℃で保存llectアリコートCVLタンパク質のELISAまたはビーズアレイ解析のために解凍が、複数回の凍結/融解サイクルを回避することができる。
5. 所望であれば、製造業者のプロトコルに従って、RNA発現を測定するために後でRNA中の細胞破片のペレットを再懸濁。

6。データ収集

1. 抗体パネルと一致する補償チューブのセットを準備します。スペクトルの重複を調整するために、補償管を実行します。そのサイトメーター任意の多色の流れにサンプルを実行するには、パネルで使用される蛍光色素標識抗体用に設定されている。
2. リンパ球集団を検出するために、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）の電圧を調整するように一PBMCサンプルを取得する。リニアスケールで、各軸の100でそれらを維持しようとします。 PBMC制御を実行すると、それは非常に簡単、CMCのリンパ球集団を見つけることになります。
3. CMCサンプルのFSC閾値は低い値でFSC SSC軸をスミアによるPBMCサンプルに対して増加される必要があり得る。
4. 取得する前に、各チューブをボルテックスする。収集されたリンパ球ゲートイベントの数を最大化するために管全体を取得する。目詰まりを避けるために慎重にマシンを監視します。
5. このようなFlowJoソフトとして、フローサイトメトリー解析プログラムにデータをエクスポートします。

7。ゲー戦略

1. 一重の人口を決定するために、前方側方散乱高（FSC-H）/前方側方散乱面積（FSC-A）を選択します。
2. 買収の品質を制御するために、蛍光マーカー対時間（たとえば、FITCなど）を選択します。流量の変化は、データ内のアーティファクトを導入することができる。流量の不一致を示している任意の領域を除外します。
3. SSC-A/FSC-Aプロット上のリンパ球集団を特定します。識別を容易にするために、PBMCコントロールを使用します。 CMCのリンパ球集団は、PBMCコントロールのように明確ではないかもしれないことに注意してください。
4. SSC-A/viability上のゲートは、生細胞から死細胞を排除するために染める。死んだ細胞は、非特異的に成果物を紹介しますこれは、抗体を組み込むことができます。
5. T細胞集団を同定するSSC-A/CD3上にゲート。この門から、CD4 +およびCD8 +集団を特定します。

結果

マルチパラメータフローサイトメトリーは、以前に特徴づけられていない組織において、細胞サブセットの表現型や機能を分析するための強力なツールです。 CMC試料の分析は、適切なゲーティング戦略を、リンパ球および単球の両方の集団についての情報を得ることができる。

代表的なCMCゲーティング戦略は、一致したPBMCプロファイルと比較して、 図2に?...

ディスカッション

女性の生殖器（FGT）の免疫に関する知識に大きなギャップを考えると、CMCで表現型分析は、子宮頸部の複数のリンパ球集団への洞察の広い配列を提供することができます。プロテオーム解析と子宮頸洗浄液中のウイルス量の測定と相まって、性感染症（STI）Sおよび他の病原体に対する免疫は、様々な集団で解剖することができます。

技術的な考慮-のCMC：CMC...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant