Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

Resumen

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Resumen

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introducción

La mayoría de las nuevas infecciones por el VIH en todo el mundo surgen a través de la transmisión heterosexual, las mujeres representan el 47% de las nuevas infecciones en 2011 (ONUSIDA ^1). Entender el tracto genital femenino (FGT), uno de los principales portales de entrada para el VIH y otros agentes patógenos de transmisión sexual, es de gran importancia en el camino hacia la búsqueda de estrategias eficaces para prevenir la infección. Las respuestas inmunes en la mucosa genital son claramente únicas y difieren de los medidos en la sangre periférica ^2. Sin embargo, los conocimientos actuales de la dinámica del sistema inmune en el FGT se limita, en el mejor. Hasta la fecha, los estudios sobre el medio ambiente inmune de la mucosa se ​​han centrado en gran medida en los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), donde se ha convertido en claro que los primeros eventos en los tejidos de las mucosas después de la infección tienen un fuerte impacto en la progresión de la enfermedad posterior ^3,4. Recogida de muestras de la mucosa genital representa un gran desafío y es al menos parcialmente responsable de la lack de comprensión de la inmunología de la FGT. Resolviendo el rompecabezas de la dinámica inmunitaria entre el huésped y el patógeno en el contexto del entorno distinto que es el FGT requiere métodos eficaces para la recogida y análisis de muestras de esta localidad.

El FGT se divide en dos secciones: el tracto reproductivo superior que incluye las trompas de Falopio, endometrio y endocérvix, y el tracto inferior que contiene el exocérvix y la vagina (revisado por Kaushic et al ^5). Aún no está claro lo que la contribución relativa de estos diferentes sitios es a la infección por el VIH, pero se cree que ambos sitios podrían contribuir a la entrada del VIH ^6. Células T representan el 40-50% de los leucocitos en los tractos reproductivos superior e inferior, mientras que los macrófagos comprenden aproximadamente el 10% (revisado en Rodríguez-García et al ^2). Las células T pueden ser detectados en la vagina, el cuello uterino, y endometrio. Los macrófagos son más fuertemente localizeta en el endometrio y el tejido conectivo del miometrio que el cuello del útero, a pesar de que se pueden detectar en ambos tejidos. Por último, las células dendríticas plasmacitoides (PDC) y células de Langerhans también pueden ser detectados en los tejidos de TGC. El fenotipo y proporciones de poblaciones inmunes y su susceptibilidad a la infección por el VIH pueden variar importante de acuerdo a los ciclos hormonales, el uso de anticonceptivos hormonales, la vaginosis bacteriana o actividades sexuales ^5,7-9.

Diversos métodos se han desarrollado para estudiar las poblaciones inmunes y el medio ambiente de la FGT. Biopsia cervical, cepillados cervicales y lavados cervicovaginales (CVL) ^10-12 son los más utilizados en toda la literatura. Colección CVL por PBS lavado es el método más simple y permite el estudio de proteínas inmunomoduladoras, pero los resultados en rendimiento extremadamente bajo de células, y por lo tanto no es adecuado para el estudio de las poblaciones de células inmunes del TGC ^13. Muestras CVL son, por otra parte, VEry útil para evaluar el entorno inmunológico del TGC mediante la medición de la expresión de diversas citoquinas, quimioquinas o factores antimicrobianos utilizando métodos tales como ELISA, de bolas de serie de citoquinas ¹⁴ o espectrometría de masas ^15,16. Caracterización de las frecuencias de células inmunes, fenotipos y funciones se puede lograr mediante la recopilación de las células mononucleares de cuello uterino (CMC) por citocepillo cervical o mediante la toma de muestras de biopsia cervical.

Toma de muestras de biopsia de cuello uterino es un método invasivo que aumenta el malestar y el riesgo de sangrado y tarda de 2 a 11 días en sanar después del procedimiento, dependiendo del estado inmunológico de la mujer ^12. Por otro lado, cepillados cervicales, a pesar de la menor rendimiento de las células recogidas, es un método menos invasivo y más conveniente para recoger las células inmunes de la TGC. Ambos métodos pueden alcanzar el mismo rendimiento de leucocitos CD45 +, pero dos cepillados cervicales secuenciales son necesarias para obtener la misma cantidad de células contenidas in una biopsia ^13. Sin embargo, el muestreo citocepillo todavía proporciona un número aceptable de células (células CD45 + sobre 5000 / citocepillo) para obtener más fenotipificación ex vivo mediante citometría de flujo ^14. Además, la caracterización funcional puede llevarse a cabo en estas muestras, como se han realizado la estimulación y citometría de flujo intracelular o qPCR utilizando CMC cytobrush derivados para identificar respuestas inmunes específicas para el VIH ¹⁷ o polarización de las células Th. ^18. La expansión de la población de células T también puede facilitar los estudios funcionales con CMC ^19.

Es importante tener en cuenta que las biopsias y cepillados muestrean porciones distintas de la TGC. Las biopsias se derivan de la parte superior del epitelio y el estroma del exocérvix ^12,13, mientras cepillados cervicales muestrean del orificio cervical, la recolección de células derivadas del epitelio del endocérvix y, presumiblemente, la zona de transformación. Por lo tanto, las muestras citocepillo muestrean una reregión compone de una sola capa de epitelio cilíndrico, mientras que las biopsias, incluyen una región de la línea por un epitelio escamoso estratificado ^5. Como resultado, la naturaleza de las poblaciones de leucocitos recogidos por biopsia cervical y citocepillo difiere. Las biopsias recogen una mayor proporción de células T CD3 +, mientras que cepillados resultan en la colección de una mayor proporción de monocitos CD14 + / macrófagos ^13.

El estudio de la inmunología de la FGT ha habido un interés por muchos años ^20-22 y hemos acumulado una gran experiencia con el estudio de los CMC cytobrush derivados. Nuestros estudios se centran principalmente en el estudio de la infección por el VIH, no infectados y expuestos al VIH seronegativos (HESN) trabajadoras sexuales de Nairobi, Kenia. El VIH se replica preferentemente en células T activadas ²³ e inferior del número de células activadas que pueden ser dirigidos por el VIH en el TGC podrían contribuir a la protección contra la adquisición del VIH. De acuerdo con esta hipótesis, varios studies han descrito la activación inmune más baja entre los trabajadores del sexo HESN que están altamente expuestos al VIH aún permanecen infectados ^24,25 y este fenotipo quiescente se observa también en el TGC ^14. Aquí se describe la metodología para la elaboración y evaluación de la activación de células T en muestras de CMC derivados de cepillados cervicales por ex vivo citometría de flujo.

Protocolo

Declaración de Ética: La ética tableros de investigación, tanto de la Universidad de Manitoba y Kenyatta Nacional Hospital / Universidad de Nairobi aprobó este estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes en el estudio.

1. Preparación de Medios y CMC Collection Tubes

1. Preparar tampón fosfato salino (PBS) (NaCl 137.93 mM, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM KH ₂ PO _4). Autoclave en la esterilidad. Esto se puede almacenar a 4 º C durante varios meses.
2. Pre-alícuota de 5 ml de PBS en 50 ml tubo Falcon (uno por cada muestra que se recogen) y se almacena a 4 º C hasta el momento de la recogida de muestras.
3. Etiquetar 2-4 crioviales o 1,5 ml tubos de microcentrífuga por muestra para recoger el lavado para su almacenamiento.
4. Preparar los medios de cultivo de células: RPMI 1640 + 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B (concentración final 100 unidades / ml, 100 mg / 250 ng / ml ml y, respectively, sin FCS / FBS agregó.

2. Toma de muestras citocepillo

Recogida de muestras cytobrush es un procedimiento no invasivo que debe ser realizada por un médico o ginecólogo entrenado.

1. Recoger las células mononucleares de cuello uterino (CMC) utilizando tanto un cytobrush y un raspador de madera o plástico. Recoger CMC del participante bajo examen con espéculo mediante la inserción del rascador y que gira alrededor del orificio cervical (Figura 1). Inserte el cytobrush en el sistema operativo endocervicales, girar 360 °, e inmediatamente colocar tanto el cytobrush y el raspador en el tubo Falcon de 50 ml que contiene 5 ml de PBS.
2. Mantener las muestras en hielo / a 4 º C hasta su procesamiento. Para mantener la viabilidad celular, muestras de proceso dentro de las 2 horas de la recogida.
3. Si es posible, recoger muestras de sangre coincidentes en la tapa verde de tubos vacutainer de heparina para células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de aislamiento para servir como un comparador / de control para el análisis de CMC.

3. Aislamiento de CMC

Lleve a cabo el procesamiento de muestras en un laboratorio de bioseguridad de nivel 2, en un gabinete de bioseguridad estéril con guantes dobles.

1. Durante la recolección, las muestras de CMC pueden contaminarse con sangre. Excluir las muestras con contaminación de la sangre visible desde el estudio con el fin de evitar la inclusión de confusión de PBMC en la muestra final. Debido al bajo número de linfocitos aislados de muestras de CMC, contaminación de la sangre menor de edad puede fácilmente abrumar el componente de linfocitos CMC.
2. Tubos Falcon Vortex que contienen tanto el cytobrush y rascador durante 45 segundos para disociar las células de los cepillos. Las muestras pueden ser espumosa durante este proceso; esto es normal.
3. Utilice la cytobrush para raspar cualquier material restante de la rasqueta, y desechar el rascador en una solución de cloro. Para recoger las células permanezcan unidas al cepillo / raspador, use un guante fresco para exprimir el rascador entre el pulgar y el índice.Deslízate por el pincel, permitiendo que las células y PBS que se recojan en el mismo tubo de 50 ml. Deseche el cytobrush en una solución de cloro, y deseche el guante.
   IMPORTANTE: Utilice un guante nuevo para cada muestra.
4. Montar un 100 m de células colador de nylon a un tubo Falcon de 50 ml fresco. Usando una pipeta de transferencia, recoger la suspensión de células de PBS desde el tubo de muestra y filtrado a través del filtro en el tubo fresco.
5. Añadir 5 ml de medio RPMI 1640 al tubo de muestra original. Utilizando la pipeta de transferencia, lavar los lados del tubo de muestra con el medio RPMI, y transferir a través del filtro para el nuevo tubo de recogida. Lavar la parte inferior del filtro de nylon con el medio RPMI así.
6. Centrifugar las muestras durante 10 min a 514 x g. Es crucial para salir de la freno de la centrífuga fuera durante este paso, con el fin de evitar el desplazamiento de la pastilla de CMC.
7. Retire con cuidado el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Tamaño de pellets será muy variable; en lome muestras, la pastilla es bastante grande debido a la presencia de grandes números de células epiteliales, mientras que en otros casos, el sedimento es apenas visible y altamente transparente.
8. Resuspender el precipitado por una ligera agitación del tubo Falcon. Añadir 5 ml de PBS para lavar la muestra.
9. Se centrifuga de nuevo durante 10 min a 514 xg sin freno de la centrífuga.
10. Elimine con cuidado el sobrenadante y volver a suspender el sedimento como anteriormente. Las células están listas, ya sea para la crioconservación (usando un protocolo de criopreservación de PBMC), la estimulación o la citometría de flujo fenotipificación.

4. CMC tinción de la superficie y Citometría de Flujo

1. Resuspender el sedimento de la etapa 3.10 en 100 l de solución de bloqueo y transferir ya sea en una placa de 96 pocillos o un tubo de FACS. La solución de bloqueo (para bloquear los receptores Fc gamma) receta es la siguiente: IgG de ratón 1,8 l (concentración final 0,2 g / l), 5 l de FBS y 93,2 l de FACS de lavado (PBS 2% de FBS).La tinción se puede realizar en una placa de 96 pocillos si los tamaños de pellets son lo suficientemente pequeños, pero puede necesitar ser realizado en tubos de FACS si gránulos son rutinariamente grande. Es importante para titular anticuerpos en consecuencia.
2. Bloquee las muestras durante 10 minutos en hielo / a 4 ° C.
3. Lavar las células con 100 l de FACS de lavado (PBS 2% de FBS) en placas de 96 pocillos, o 500 l en tubos de FACS. Se centrifuga a 600 × g durante 10 min a 4 ° C con el freno de baja (o desactivar, si un nivel bajo de freno no está disponible).
4. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular por agitación. Añadir Stain viabilidad (Live colorante de viabilidad fixable Dead). Preparar colorante de viabilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es posible que haya que valora para su uso en cada configuración de laboratorio / citómetro. Incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 ° C.
5. Lavar las células 100 μl/500 l de PBS (para tubos de placa / FACS de 96 pocillos). Se centrifuga a 600 × g durante 10 min con baja / no freno. Retire supernatant y se resuspenden las células.
6. Se incuban las células con el cóctel de anticuerpos de marcadores de superficie, en un volumen total de 100 l. IMPORTANTE: Optimizar y valorar cada una de citometría de flujo de la comisión antes de probar las manchas. Se incuban las células durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
7. Repita el paso 4.5. si la tinción en una placa de 96 pocillos, las células de transferencia a un tubo de FACS y se diluye hasta un volumen final de 750 l de FACS de lavado que contiene 1% de paraformaldehído (PFA) (o CytoFix, se diluyó 1 en 4). Proceder a la adquisición de datos en un citómetro de flujo.

5. Recogida y preparación de Cervical Vaginal Lavado (CVL)

1. Antes de citocepillo de muestreo, utilizar una jeringa para lavar la endocérvix con 2 ml de PBS estéril y aspirar el lavado del fórnix posterior.
2. Recoger la muestra de lavado aspirado en un tubo Falcon de 15 ml y mantener en hielo / a 4 º C hasta su procesamiento.
3. Centrifugar la muestra a 400 xg durante 7 minutos para eliminar los desechos celulares.
4. Collect el sobrenadante, alícuota de la muestra en 1 ml o 500 ml de alícuotas y se almacena a -70 ° C. Las alícuotas se pueden descongelar para ELISA o análisis de bolas de serie de proteínas CVL, pero evitar los ciclos de congelación / descongelación.
5. Si se desea, resuspender el sedimento de restos celulares en el ARN Más tarde para medir la expresión de ARN siguiendo el protocolo del fabricante.

6. Adquisición de Datos

1. Prepare un conjunto de tubos de compensación que coincide con el panel de anticuerpos. Ejecutar los tubos de compensación para ajustar la superposición espectral. Ejecute las muestras de ningún flujo multicolor citómetro de que está configurado para los anticuerpos conjugados con fluorocromos utilizados en el panel.
2. Adquirir una muestra PBMC primero para ajustar la dispersión hacia adelante (FSC) y la dispersión lateral (SSC) de tensión a fin de detectar la población de linfocitos. Trate de mantenerlos a 100 en cada eje en una escala lineal. Ejecución de un control de PBMC hará que sea mucho más fácil para encontrar la población de linfocitos CMC.
3. El umbral de FSC para las muestras de CMC puede ser necesario un aumento con respecto a las muestras de PBMC debido a manchar el eje SSC a bajos valores de FSC.
4. Agite cada tubo antes de adquirir. Adquirir la totalidad del tubo para maximizar el número de eventos puerta de linfocitos recogidos. Vigilar la máquina con cuidado para evitar obstrucciones.
5. Exportar los datos a un programa de análisis de citometría de flujo tal como FlowJo.

7. Estrategia Gating

1. Seleccione dispersión lateral delantero alto (FSC-H) / área de dispersión lateral frontal (FSC-A) para determinar la población singlete.
2. Seleccione Hora frente marcador fluorescente (como ejemplo FITC) para controlar por la calidad de la adquisición. Cambio en la tasa de flujo puede introducir artefactos en los datos. Excluir cualquier área que muestra la discrepancia en el caudal.
3. Identificar la población de linfocitos en SSC-A/FSC-A parcela. Utilice un control PBMC para facilitar la identificación. Tenga en cuenta que la población de linfocitos CMC podría no ser tan claro como el control de PBMC.
4. Puerta en SSC-A/viability tinte para excluir las células muertas de células vivas. Las células muertas pueden incorporar de forma no específica de los anticuerpos, que introducirá los artefactos.
5. Puerta en la SSC-A/CD3 para identificar la población de células T. Desde esta puerta, identificar las poblaciones CD4 + y CD8 +.

Resultados

Citometría de flujo multiparamétrica es una herramienta poderosa para diseccionar los fenotipos y las funciones de los subconjuntos de células en los tejidos previamente sin caracterizar. Análisis de muestras de CMC puede dar información tanto de linfocitos y monocitos poblaciones con estrategias apropiadas de compuerta.

Una estrategia de activación periódica CMC representante, en comparación con un perfil de PBMC emparejado, se muestra en la Figura 2. El FSC-A frent...

Discusión

Dadas las grandes lagunas de conocimiento con respecto a la inmunidad en el tracto genital femenino (FGT), el análisis fenotípico de los CMC puede proporcionar una amplia gama de puntos de vista en varias poblaciones de linfocitos en el cuello uterino. Junto con el análisis proteómico y mediciones de carga viral en el lavado de cuello de útero, la inmunidad a las infecciones de transmisión sexual (ITS) s y otros patógenos puede ser diseccionado en varias poblaciones.

Considera...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant