左冠状动脉前降支的小鼠结扎:对心肌梗死后重塑和心衰模型

摘要

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

摘要

心脏衰竭是其中心脏不能泵送血液的速率与在休息或应激期间蜂窝氧气要求相称的综合症。它的特征是液体潴留，气短，和疲劳，特别是在消耗。心脏衰竭是一个日益严重的公共健康问题，住院的主要原因，和死亡的一个主要原因。缺血性心脏疾病是心脏衰竭的主​​要原因。

心室重塑是指改变结构左心室，大小和形状。这种建筑的左心室重塑被损伤（ 例如，心肌梗塞）引起的，通过压力负荷（ 例如，全身性动脉高血压或主动脉瓣狭窄），或按体积超负荷。由于心室重构影响墙体的压力，但对心功能和心脏衰竭的发展产生深远的影响。左前descendin永久性结扎模型克冠状动脉小鼠被用来研究心室重构和心脏功能后​​心肌梗死。该模型是在目标和病理生理学的相关方面相比左前降冠状动脉的瞬态结扎模型根本的不同。在后一种缺血/再灌注损伤模型，梗死的初始程度可以通过影响心肌打捞再灌注因素进行调制。与此相反，在梗塞面积在左前降冠状动脉的永久结扎后24小时，是固定的。在此模型中的心功能会受1）梗塞扩展，梗塞愈合，和瘢痕形成的方法; 2）左心室扩张，心肌肥厚，心室重构伴随发展。

除了左前永久性结扎的下行冠状动脉，浸润性血液动力学MEA的技术中的模型小鼠surements中详细介绍。

引言

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with the cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure¹.

Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. In other words, ventricular remodelling concerns an alteration of the left ventricular architecture. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload (e.g., mitral insufficiency). Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure.

Loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a decreased systolic ejection and an increased left ventricular end-diastolic volume and pressure. The Frank-Starling mechanism, implying that an increased end-diastolic volume results in an increased pressure developed during systole, may help to restore cardiac output. However, the concomitant increased wall stress may induce regional hypertrophy in the non-infarcted segment, whereas in the infarcted area expansion and thinning may occur. Experimental animal studies show that the infarcted ventricle hypertrophies and that the degree of hypertrophy is dependent on the infarct size².

The loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a sudden increase in loading conditions. Post-infarct remodelling occurs in the setting of volume overload, since the stretched and dilated infarcted tissue increases the left ventricular volume. An increased ventricular volume not only implies increased preload (passive ventricular wall stress at the end of diastole) but also increased afterload (total myocardial wall stress during systolic ejection). Afterload is increased since the systolic radius is increased. Therefore, ventricular remodelling post-myocardial infarction is characterized by mixed features of volume overload and pressure overload.

The myocardium consists of 3 integrated components: cardiomyocytes, extracellular matrix, and the capillary microcirculation. All 3 components are involved in the remodelling process. Matrix metalloproteinases produced by inflammatory cells induce degradation of intermyocyte collagen struts and cardiomyocyte slippage. This leads to infarct expansion characterized by the disproportionate thinning and dilatation of the infarct segment³. In later stages of remodelling, interstitial fibrosis is induced, which negatively affects the diastolic properties of the heart.

The vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium should remain balanced in the process of ventricular remodelling to avoid tissue hypoxia^4,5. Whether hypertrophy progresses to heart failure or not may be critically dependent on this balance between the vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium.

A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion⁶. In contrast, the infarct area at 24 hours after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.

研究方案

注意:本节中描述的所有实验程序批准的机构动物护理和鲁汶大学的研究咨询委员会（项目:二千零十三分之一百五十四-B德范）。

左冠状动脉前降支1结扎

1. 麻醉小鼠通过的40毫克/千克腹膜内给药至70mg戊巴比妥钠的/公斤。确保鼠标达到其应有的麻醉平面，当它不再反应的公司脚趾捏。一定要确认正确麻醉之前，任何外科手术或介入这种方式。使用润滑眼药膏，以防止角膜干燥的同时，在麻醉下。步骤（丁丙诺啡0.05毫克/公斤SQ）的开始之前提供的术前麻醉2-4小时。
   1. 在生存手术应用一致的无菌技术。实施抑制到最大可能的程度上的微生物CON程序污染从而显著感染或化脓不会发生。这些程序包括使用无菌器械和无菌材料，手术区消毒，并去除毛皮/毛过这个网站的手术部位消毒。
2. 插管的小鼠具有自钝制备20号针头。
   1. 把鼠标在仰卧位，头部过伸。
      1. 着眼于颈部区域的光。提起用钝pincet舌头。喉部的入口可以清楚地看到。
      2. 经过喉部的钝针头插入直视下气管。通过鼠标连接到呼吸机评估正确的插管（每搏输出量在微升:3×体重（克）+ 155;频率:每分钟120次）。
   2. 另外，通过先仔细暴露气管增强气管插管的可视化。
      1. 做一个5毫米的中颈部切口和缩回肌肉组织只是气管上方。
      2. 执行使用手术立体的气管直接可视化的气管插管。抬起舌并输入自制备钝化20号针头进入气管。通过鼠标连接到呼吸机确认无误插管（每搏输出量在微升:3×体重（克）+ 155;频率:每分钟120次）。
3. 按住鼠标在仰卧位和修复鼠标用胶带。在加热垫进行手术，以防止体温过低。
   1. 刮胡子和消毒用聚维酮碘皮肤。注意使左后肢穿过右后肢，以便在手术过程中获得关于左心室更好的视野。
4. 使一个小的横向皮肤切口到胸骨并分离下面的皮肤和肌肉。
5. 拉米一边。胸小肌和M。胸大肌用5-0丝线缝合。
6. 做一个我ncision在第三肋间隙通过插入一个钝pincet。
7. 移动下肋间肌从横向的pincet向内侧到胸骨为止。通过从内到皮肤推pincet穿刺胸壁。通过仔细切割肋间肌只是用小剪刀将pincet上面完成开胸手术。使用这种技术，以防止肺部穿刺。
8. 把浸渍于0.9％的NaCl的海绵进入空腔，以保护肺部。引入一个伤口吊具（胸牵开器）插入肋间空间，以获得心脏的左侧的曝光。截至目前，左心房，左心室，左冠状动脉前降支是立体显微镜下可见的。
9. 执行左冠状动脉前降支约左心房的尖端之下1mm的单个6-0 Prolene线结扎的结扎。这是从第一对角支远侧。
   注:另外，7-0（00.05毫米直径）或8-0线程（0.04毫米直径）可被使用。针是C-113毫米3/8圆锥角针。左冠状动脉前降支动脉结扎术成功立即引起变色，导致受影响的领土苍白出现心肌。
10. 取出伤口吊具（胸部拉钩）。
    1. 将三个6-0的Ti-的Cron缝线周围的肋间。前收紧缝合线，从胸腔除去海绵和通过阻断呼吸机的流出重新展开肺部。通过这样做，肺部重新与壁层胸膜。
    2. 随后，拉动缝线紧，向下按在胸前重复再扩张。确认使用少量盐水的胸廓的成功关闭（无气泡，必须对胸部施加压力时可以看到的）。
    3. 期待通过肋间肌，确认肺部正常的扩张。重新定位双方胸大肌肌肉，作为一个额外的障碍预防气胸。
11. 关闭用5-0丝缝合皮肤。
12. 从呼吸机断开鼠标，并允许恢复加热垫。不要让动物无人看管，直到它恢复足够的意识，保持胸骨斜卧。不返回已经历手术给其他动物的公司，直到完全恢复的动物。
13. 始终如一地提供术后镇痛（丁丙诺啡0.05毫克/公斤SQ BID至少48小时手术后）。

2. 在体内创血流动力学测量小鼠

1. 在手术前，淹没在无菌水中的1.0法国米勒压力导管在37℃下至少30分钟，以最小化信号漂移。电子校准在0毫米汞柱和100毫米汞柱和记录数据的压力传感器在2000赫兹。
2. 由1.4克/公斤氨基甲酸酯腹膜内给药进行麻醉。检查鼠标达到其应有的麻醉平面，当它不再反应的公司脚趾捏。
3. 将鼠标麻醉仰卧位。确保其四肢用胶带。保持体温与加热垫和监控与直肠探头。剃颈部区域，使一个中线切口，在颈部区域，以暴露甲状腺。
4. 修正了弯针的脖子。
5. 拉拨唾液腺和暴露右颈总动脉。迷走神经，它类似于一白线，沿着所述动脉。小心用弯钳从迷走神经分离颈动脉。
6. 通过右颈总动脉下一个弯钳将其从其它组织中分离出来。动脉周围除去结缔组织。
7. 通过右颈总动脉下的两个6-0丝导线。就顶丝，它被放置在头紧一紧结，并配有科赫尔（远端闭塞结扎）修复。通过PROXI发作丝两次从左至右并用2 kochers（近侧非闭塞性线）固定。
8. 保持颈动脉湿润滴加无菌的0.9％NaCl。擦干多余的液体用棉签。
9. 使在右颈总动脉中的切口与远侧结扎和近侧非闭塞性导线之间的26号针头。
10. 推出压力传感器到动脉。确认没有失血。轻轻的1.0法国米勒压力导管推进并以这样的方式，该导管可以通过锁骨下导线小心通过调整近侧非闭塞性导线。
    1. 调整近侧非闭塞丝期间尽量减少失血。不压缩的压力传感器同时推进，因为它是很脆弱的太多了。由于近端线不得堵塞动脉，血管应保持充满血液。
11. 开始录制的压力信号。动脉压力信号fluctuatES在60的舒张压之间的健康小鼠 - 70毫米汞柱和100的收缩压 - 120毫米汞柱。
12. 经由无名动脉并经由主动脉进入左心室直接导管。 120毫米汞柱 - 0毫米汞柱和100之间的心室压力波动。允许导管到左心室内稳定。记录信号进行30分钟至60分钟，这取决于实验的要求。
13. 在实验结束后，浸泡在Alconox清洁剂的1％的导管30分钟。洗用Milli-Q水的导管。存储导管在泡沫块。
14. 检索作进一步分析录音软件数据。
    1. 进行数据分析，考虑一个时间间隔，其中所述压力信号是稳定的。选择感兴趣的记录的数据中的至少10个连续心脏周期。
    2. 使用LabChart软件版本8.0或类似的分析心脏率，最大收缩期左室压力，最小舒张左ventricular压，等容左心室收缩（DP / dt _最大值 ），等容左心室舒张（DP / DT _分钟 ），舒张末期左心室压力的峰值速率的峰值速率，以及等容左心室的时间常数压降（头^）7。
       注:舒张末期压力对应于在该时间点立即诱导等容收缩压力骤增之前的压力。 tau蛋白的计算是基于左心室压力配合到一个单指数衰减曲线，表示为_P（T）= P _{0 E} ^{-t / tau蛋白} + B，在该公式中_，P（t）是在时刻左心室压力之后DP / dt的的最大负值吨已经达到。参数b对应于理论渐近线，它在一个简化的方法可以假定为零。增强等容舒张导致tau的一个较小的值。

结果

心肌梗死的程度可以通过伊文思蓝/ 2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）双重染色来评估。 TTC是氧化还原指示剂，其被转换为深红色-1,3,5- triphenylformazan在活由于NADH ⁸的存在，各种脱氢酶的活性组织中。 图1示出的心脏的代表性部分中，在24小时后结扎左冠状动脉前降支的。蓝染的区域表示非缺血/正常区域。在危险的心肌区域被定义为灌注从左前降冠状动脉的结扎远侧床内的心肌组织。...

讨论

在心肌的结构和功能的慢性变化，左心功能不全的发展，并进展到心脏衰竭可以几种鼠模型¹²进行调查。心脏重塑和功能障碍可以通过心肌损伤可诱发或压力过载继发于横向主动脉缩窄，或可在扩张型心肌病¹²的遗传模型进行研究。显然，小鼠模型的最显着优点是转基因和基因敲除菌株，包括细胞类型特异性和可诱导的转基因模型中的大量的可用性。评价在这些模型心脏重构的已?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Buprenorphine (Buprenex®)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal®)	Ceva
Betadine®	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Equipment
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3mm x 3mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.