Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Zusammenfassung

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Zusammenfassung

Herzinsuffizienz ist ein Syndrom, bei dem das Herz nicht Blut bei einer Rate mit zellulären Sauerstoffbedarf in Ruhe oder unter Belastung zu pumpen. Es wird von Flüssigkeitsretention, Kurzatmigkeit und Müdigkeit, insbesondere bei Belastung gekennzeichnet. Herzinsuffizienz ist ein wachsendes Problem der öffentlichen Gesundheit, die häufigste Ursache für Krankenhausaufenthalt und eine der Hauptursachen der Sterblichkeit. Ischämische Herzerkrankung ist die Hauptursache der Herzinsuffizienz.

Remodeling bezeichnet Änderungen der Struktur, Größe und Form des linken Ventrikels. Diese architektonischen Remodellierung des linken Ventrikels durch Verletzung (zB Myokardinfarkt) induziert, die durch Drucküberlastung (zB arterielle Hypertonie oder Aortenstenose) oder durch Volumenüberlastung. Seit Remodeling wirkt Wandspannung, es hat eine tiefgreifende Wirkung auf die Herzfunktion und auf die Entwicklung einer Herzinsuffizienz. Ein Modell der permanenten Ligatur der linken vorderen descending Koronararterie bei Mäusen wird verwendet, um ventrikuläre Remodeling und die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Dieses Modell ist in Bezug auf die Ziele und die pathophysiologische Relevanz im Vergleich zum Modell der vorübergehenden Unterbindung der linken vorderen absteigenden Koronararterie grundlegend anders. In diesem letzteren Modell der Ischämie / Reperfusionsverletzung, kann das anfängliche Ausmaß des Infarkts durch Faktoren, Myocardial Salvage nach Reperfusion beeinträchtigt moduliert werden. Im Gegensatz dazu ist der Infarktbereich bei 24 Stunden nach der Dauerunterbindung der linken vorderen absteigenden Koronararterie befestigt. Die Herzfunktion in diesem Modell wird durch 1) den Prozess der Infarktausdehnung, Infarkt Heilung und Narbenbildung beeinträchtigt werden; und 2) die gleichzeitige Entwicklung der Dilatation des linken Ventrikels, Herzhypertrophie und Remodeling.

Neben dem Modell der permanenten Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie, die Technik der invasive hämodynamische measungen bei Mäusen wird im Detail vorgestellt.

Einleitung

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with the cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure¹.

Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. In other words, ventricular remodelling concerns an alteration of the left ventricular architecture. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload (e.g., mitral insufficiency). Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure.

Loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a decreased systolic ejection and an increased left ventricular end-diastolic volume and pressure. The Frank-Starling mechanism, implying that an increased end-diastolic volume results in an increased pressure developed during systole, may help to restore cardiac output. However, the concomitant increased wall stress may induce regional hypertrophy in the non-infarcted segment, whereas in the infarcted area expansion and thinning may occur. Experimental animal studies show that the infarcted ventricle hypertrophies and that the degree of hypertrophy is dependent on the infarct size².

The loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a sudden increase in loading conditions. Post-infarct remodelling occurs in the setting of volume overload, since the stretched and dilated infarcted tissue increases the left ventricular volume. An increased ventricular volume not only implies increased preload (passive ventricular wall stress at the end of diastole) but also increased afterload (total myocardial wall stress during systolic ejection). Afterload is increased since the systolic radius is increased. Therefore, ventricular remodelling post-myocardial infarction is characterized by mixed features of volume overload and pressure overload.

The myocardium consists of 3 integrated components: cardiomyocytes, extracellular matrix, and the capillary microcirculation. All 3 components are involved in the remodelling process. Matrix metalloproteinases produced by inflammatory cells induce degradation of intermyocyte collagen struts and cardiomyocyte slippage. This leads to infarct expansion characterized by the disproportionate thinning and dilatation of the infarct segment³. In later stages of remodelling, interstitial fibrosis is induced, which negatively affects the diastolic properties of the heart.

The vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium should remain balanced in the process of ventricular remodelling to avoid tissue hypoxia^4,5. Whether hypertrophy progresses to heart failure or not may be critically dependent on this balance between the vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium.

A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion⁶. In contrast, the infarct area at 24 hours after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Abschnitt beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Forschung Beirat der Katholieke Universiteit Leuven genehmigt (Projekt: 154/2013-B De Geest).

1. Ständige Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie

1. Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Verabreichung von 40 mg / kg bis 70 mg / kg Natriumpentobarbital. Stellen Sie sicher, die Maus an ihre richtige Ebene der Anästhesie, wenn es nicht mehr einen festen Zehe Prise reagiert. Überprüfen Sie stets die ordnungsgemäße Betäubung auf diese Weise vor jedem chirurgischen Eingriff oder Intervention. Verwenden Sie Schmieraugensalbe zur Trockenheit der Hornhaut während der Narkose zu verhindern. Bereitzustellen präoperative Analgesie 2-4 h vor dem Start des Verfahrens (Buprenorphin 0,05 mg / kg SQ).
   1. Bewerben konsequente aseptische Technik bei Überleben Chirurgie. Umsetzung von Verfahren, die zu einem maximal möglichen Ausmaß mikrobieller con hemmenVerschmutzung, so dass signifikante Infektion oder Eiterung nicht auftritt. Diese Verfahren umfassen die Verwendung von sterilen Instrumenten und sterilen Materialien, Desinfektion der OP-Bereich, und die Entfernung von Fell / Haar über der Operationsstelle und Desinfektion dieser Website.
2. Intubieren Sie die Maus mit einem selbst zubereiteten abgestumpft 20-Gauge-Nadel.
   1. Sie mit der Maus in Rückenlage mit Überstreckung des Kopfes.
      1. Stellen Sie das Licht auf den Halsbereich. Heben Sie die Zunge mit einer stumpfen Pinzette. Der Eingang des Kehlkopfes ist deutlich zu erkennen.
      2. Übergeben Sie die stumpfe Nadel durch den Kehlkopf in die Luftröhre unter direkter Sicht. Beurteilen Sie korrekte Intubation, indem Sie die Maus an das Beatmungsgerät (Schlagvolumen in ul: 3 x Körpergewicht (g) + 155; Frequenz: 120 Hübe pro Minute).
   2. Alternativ zu verbessern Visualisierung der Intubation, indem Sie zuerst sorgfältig Freilegung der Luftröhre.
      1. Machen Sie eine 5 mm Mitte der Halsschnitt und einfahrenMuskelgewebe knapp oberhalb der Luftröhre.
      2. Führen Sie die Intubation mit einem OP-Stereomikroskop für die direkte Visualisierung der Luftröhre. Heben Sie die Zunge und geben Sie den selbst zubereiteten abgestumpft 20-Gauge-Nadel in die Luftröhre. Bestätigen der ordnungsgemäßen Intubation, indem Sie die Maus an das Beatmungsgerät (Schlagvolumen in ul: 3 x Körpergewicht (g) + 155; Frequenz: 120 Hübe pro Minute).
3. Halten Sie die Maus in Rückenlage und fixieren Sie die Maus mit Klebeband. Führen der Operation auf einem Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern.
   1. Rasur und desinfizieren Sie die Haut mit Betadine. Darauf achten, dass der linke Hinterbein kreuzt die rechte Hintergliedmaße, um eine bessere Sicht auf die linke Herzkammer während der Operation zu erhalten.
4. Machen Sie einen kleinen Querhautschnitt bis zum Brustbein und trennen Sie die darunter liegende Haut und Muskeln.
5. Ziehen Sie abgesehen von der m. pectoralis minor und m. pectoralis major mit einem 5-0 Seidennaht.
6. Machen Sie ein incision im dritten Zwischenrippenraum, indem Sie einen stumpfen Pinzette.
7. Bewegen Sie den pincet unter den Zwischenrippenmuskeln von lateral nach medial, bis das Brustbein erreicht ist. Punktion der Brustwand, indem Sie den pincet von innen auf die Haut. Füllen Sie das Thorakotomie durch vorsichtiges Schneiden der Zwischenrippenmuskel direkt über dem pincet mit einer kleinen Schere. Mit dieser Technik können Punktion der Lunge zu verhindern.
8. Bringe einen Schwamm in 0,9% NaCl eingetaucht in den Hohlraum, um die Lungen zu schützen. Einführen eines Wundspreizer (Brust Retraktor) in den Interkostalraum, um die Exposition der linken Seite des Herzens zu erhalten. Ab jetzt der linke Vorhof, den linken Ventrikel und die linke vordere absteigende Koronar-Arterie unter dem Stereomikroskop sichtbar.
9. Durchführen einer Unterbindung der linken vorderen absteigenden Koronararterie mit einem einzigen 6-0 Prolene Ligatur etwa 1 mm unter der Spitze des linken Atriums. Dies ist distal von der ersten Diagonalzweig.
   HINWEIS: Alternativ 7-0 (0.05 Mm Durchmesser) oder 8-0 Fäden (0,04 mm Durchmesser) verwendet werden können. Die Nadel ist ein C-1 13 mm 3/8 Kreis Nadel mit abgeschrägter Spitze. Erfolgreiche Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie induziert sofortige Entfärbung, was zu einem blasserscheine Myokard in dem betroffenen Gebiet.
10. Entfernen Sie die Wundspreizer (Brust Aufroller).
    1. Platzieren Sie drei 6-0 Ti-Cron Nähte auf der Zwischenrippenraum. Vor dem Anziehen der Fäden, entfernen Sie den Schwamm aus der Brusthöhle und wieder auszubreiten die Lunge durch die Blockierung der Abfluss von dem Beatmungsgerät. Auf diese Weise verbinden die Lungen mit der Pleura parietalis.
    2. Anschließend eng ziehen die Fäden und wiederholen Wiederausdehnung durch Drücken auf der Brust. Bestätigen den erfolgreichen Abschluss des Thorax unter Verwendung einer kleinen Menge an Salzlösung (keine Luftblasen, wenn Druck auf die Brust zu sehen).
    3. Schauen Sie durch den Zwischenrippenmuskel, um normale Ausdehnung der Lunge zu bestätigen. Positionieren Sie die beiden Brustmuskeln, als dienzusätzliche Barriere für die Verhinderung eines Pneumothorax.
11. Schließen Sie die Haut mit 5-0 Seidennahtmaterial.
12. Trennen Sie die Maus vom Beatmungsgerät und eine Wiederherstellung auf dem Heizkissen. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
13. Konsequent bieten postoperativen Analgesie (Buprenorphin 0,05 mg / kg SQ BID für mindestens 48 Stunden nach der Operation).

2. In-vivo-invasive hämodynamische Messungen an der Maus

1. Vor dem Eingriff Tauchen Sie das 1.0 Französisch Millar Druckkatheter in sterilem Wasser bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten, um die Signaldrift zu minimieren. Elektronisch des Drucksensors bei 0 mm Hg und 100 mm Hg und Aufzeichnungsdaten bei 2.000 Hz kalibrieren.
2. Führen Anästhesie durch intraperitoneale Verabreichung von 1,4 g / kg Urethan. Überprüfen Sie, obdie Maus an ihre richtige Ebene der Anästhesie, wenn es nicht mehr einen festen Zehe Prise reagiert.
3. Setzen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage. Sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen und mit einem rektale Sonde überwachen. Rasieren Sie den Halsbereich und einen Mittellinienschnitt im Halsbereich, um die Schilddrüse aus.
4. Befestigen Sie den Ausschnitt mit verbogenen Nadeln.
5. Ziehen Sie abgesehen von der Speicheldrüse und setzen die rechte Arteria carotis communis. Der Vagusnerv, der einen weißen Faden ähnelt, liegt entlang der Arterie. Vorsichtig die Halsschlagader von den Vagusnerv Verwendung eines gebogenen Pinzette.
6. Übergeben einer gekrümmten Pinzette unter der rechten gemeinsamen Halsschlagader, um sie von anderen Geweben abzutrennen. Entfernen Bindegewebe um die Arterie.
7. Führen Sie zwei 6-0 Seiden Drähte unter der rechten Halsschlagader. Machen Sie einen festen Knoten auf der obersten Draht, der in Richtung des Kopfes, in der Nähe platziert ist, und befestigen Sie mit einem kocher (distalen Verschlussligation). Übergeben Sie die proximal Draht zweimal von links nach rechts und befestigen Sie sie mit 2 Kochers (proximal nichtokklusiven Draht).
8. Halten Sie die Halsschlagader feucht durch Fallen steriler 0,9% NaCl. Trocknen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Wattestäbchen.
9. Einen Einschnitt in die rechte Arteria carotis communis mit einer 26-Gauge-Nadel zwischen dem distalen und dem proximalen Ligierung Nichtokklusives Draht.
10. Führen Sie den Drucksensor in die Arterie. Stellen Sie sicher, dass es keinen Blutverlust. Schieben Sie die 1,0 Französisch Millar Druckkatheter nach vorne und stellen Sie den proximalen nichtokklusiven Draht in einer Weise, dass der Katheter vorsichtig durch den Draht unter dem Schlüsselbein weiterzugeben.
    1. Minimierung der Blutverlust während der Einstellung des proximalen Nichtokklusives Draht. Den Drucksensor zu viel beim Vorrücken da es sehr instabil nicht komprimieren. Da der proximale Draht muss die Arterie nicht verschließen, sollte das Gefäß mit Blut gefüllt bleiben.
11. Starten Sie die Aufnahme des Drucksignals. Eine arterielle Drucksignal fluctuates in einer gesunden Maus zwischen einem diastolischen Druck von 60 bis 70 mm Hg und einem systolischen Blutdruck von 100 bis 120 mm Hg.
12. Lenken des Katheters über den Truncus und über die Aorta in den linken Ventrikel. Der Kammerdruck schwankt zwischen 0 mm Hg und 100 bis 120 mm Hg. Zulassen, dass der Katheter in der linken Herzkammer zu stabilisieren. Nehmen das Signal für 30 min bis 60 min in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen.
13. Nach Beendigung des Versuchs, genießen Sie den Katheter in Alconox 1% für 30 min. Den Katheter mit Milli-Q-Wasser waschen. Lagern Sie den Katheter in einer Schaumstoffblock.
14. Abrufen von Daten von der Software zur weiteren Analyse.
    1. Für die Datenanalyse, halten eine Zeitspanne, wo das Drucksignal stabil ist. Wählen mindestens 10 aufeinanderfolgenden Herzzyklen der aufgezeichneten Daten von Interesse.
    2. Verwenden LabChart Software Version 8.0 oder ähnlich wie die Herzfrequenz, die maximale systolische linksventrikuläre Druck, den minimalen diastolischen linken ventr analysierenicular Druck, die Spitzenrate der isovolumetrischen linken ventrikulären Kontraktion (dP / dt _max), der Spitzenrate der isovolumetrischen linksventrikulären Relaxation (dP / dt _min), enddiastolischen linksventrikulären Drucks und die Zeitkonstante der linksventrikulären isovolumetrischen Druckabfall (tau) ^7.
       HINWEIS: Der enddiastolische Druck entspricht dem Druck, bei dem Zeitpunkt, unmittelbar bevor die Druckwelle durch die isovolumetrischen Kontraktion induziert. Die Berechnung von Tau auf der Montage der linksventrikuläre Druck in einen monoexponentiellen Verlauf basieren, ausgedrückt als P _(t) = P ₀ ^{e-t / & tau} + b, In dieser Formel ist P _(t) ist die linke Herzkammerdruck zum Zeitpunkt t nach dem maximalen negativen Wert von dP / dt erreicht wurde. Der Parameter b entspricht der theoretischen Asymptote, die in einem vereinfachten Ansatz kann als Null angenommen werden. Verbesserte isovolumetrischen Entspannung führt zu einem kleineren Wert von tau.

Ergebnisse

Das Ausmaß der Myokardinfarkt kann durch Evans blue / 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Doppelfärbung beurteilt werden. TTC ist ein Redox-Indikator, der tiefroten 1,3,5-triphenylformazan in lebenden Geweben aufgrund der Aktivität verschiedener Dehydrogenasen in Gegenwart von NADH ⁸ umgewandelt wird. 1 zeigt einen repräsentativen Abschnitt des Herzens bei 24 h nach der Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie. Blau gefärbte Bereiche zeigen nicht-ischämischen / norma...

Diskussion

Chronischer Veränderungen der myokardialen Struktur und Funktion, kann die Entwicklung von linksventrikulärer Dysfunktion und Progression von Herzinsuffizienz in verschiedenen Mausmodellen ¹² untersucht werden. Kardialen Remodeling und Funktionsstörungen können durch myokardiale Verletzungen oder induziert werden durch Drucküberlastung Sekundär der Quer Aortenkonstriktion, oder in genetischer Modelle der dilatativen Kardiomyopathie ¹² untersucht werden. Offensichtlich ist die am stärksten au...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Buprenorphine (Buprenex®)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal®)	Ceva
Betadine®	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Equipment
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3mm x 3mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.