Постоянный Лигирование артерии передней нисходящей коронарной у мышей: Модель, перенесших инфаркт миокарда ремоделирования и сердечной недостаточности

Резюме

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Аннотация

Сердечная недостаточность синдром, в котором сердце не может перекачивать кровь со скоростью, соизмеримой с сотовыми потребности в кислороде в покое или во время стресса. Она характеризуется задержкой жидкости, одышка и усталость, в частности при физической нагрузке. Сердечная недостаточность является растущей проблемой общественного здравоохранения, основной причиной госпитализации, и основной причиной смертности. Ишемическая болезнь сердца является основной причиной сердечной недостаточности.

Желудочка ремоделирование относится к изменениям в структуре, размера и формы левого желудочка. Этот архитектурный ремоделирование левого желудочка, индуцированная травмой (например, инфаркт миокарда), из-за перегрузки давлением (например, системная артериальная гипертензия или стеноз аорты) или перегрузки объемом. С желудочка ремоделирование влияет стенки стресс, он имеет огромное влияние на сердечную функцию и на развитие сердечной недостаточности. Модель постоянного лигирования левой передней descendinг коронарной артерии у мышей используется для исследования желудочка ремоделирование и функции сердца после инфаркта миокарда. Эта модель принципиально отличается с точки зрения целей и патофизиологических релевантности по сравнению с моделью переходного перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии. В этом последнем модели травмы ишемии / реперфузии, начальная степень инфаркта может модулироваться факторов, которые влияют на спасение миокарда после реперфузии. В отличие от этого, инфаркт площадь в 24 часа после постоянного лигирования левой передней нисходящей коронарной артерии фиксируется. Сердечная деятельность в этой модели будет зависеть от 1) процесс расширения инфаркта, инфаркта исцеления, и образованием рубцов; и 2) сопутствующее развитие дилатации левого желудочка, сердечной гипертрофии и ремоделирования желудочков.

Кроме того, модели постоянного перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии, технику инвазивного гемодинамического МЭАрения у мышей представлен в деталях.

Введение

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with the cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure¹.

Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. In other words, ventricular remodelling concerns an alteration of the left ventricular architecture. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload (e.g., mitral insufficiency). Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure.

Loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a decreased systolic ejection and an increased left ventricular end-diastolic volume and pressure. The Frank-Starling mechanism, implying that an increased end-diastolic volume results in an increased pressure developed during systole, may help to restore cardiac output. However, the concomitant increased wall stress may induce regional hypertrophy in the non-infarcted segment, whereas in the infarcted area expansion and thinning may occur. Experimental animal studies show that the infarcted ventricle hypertrophies and that the degree of hypertrophy is dependent on the infarct size².

The loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a sudden increase in loading conditions. Post-infarct remodelling occurs in the setting of volume overload, since the stretched and dilated infarcted tissue increases the left ventricular volume. An increased ventricular volume not only implies increased preload (passive ventricular wall stress at the end of diastole) but also increased afterload (total myocardial wall stress during systolic ejection). Afterload is increased since the systolic radius is increased. Therefore, ventricular remodelling post-myocardial infarction is characterized by mixed features of volume overload and pressure overload.

The myocardium consists of 3 integrated components: cardiomyocytes, extracellular matrix, and the capillary microcirculation. All 3 components are involved in the remodelling process. Matrix metalloproteinases produced by inflammatory cells induce degradation of intermyocyte collagen struts and cardiomyocyte slippage. This leads to infarct expansion characterized by the disproportionate thinning and dilatation of the infarct segment³. In later stages of remodelling, interstitial fibrosis is induced, which negatively affects the diastolic properties of the heart.

The vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium should remain balanced in the process of ventricular remodelling to avoid tissue hypoxia^4,5. Whether hypertrophy progresses to heart failure or not may be critically dependent on this balance between the vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium.

A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion⁶. In contrast, the infarct area at 24 hours after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры, описанные в этом разделе, были утверждены уходу за животными и Научно-консультативного комитета по Католического университета Левена институционального (Проект: 154/2013-B De Geest).

1. Постоянный Лигирование артерии передней нисходящей коронарной

1. Обезболить мыши внутрибрюшинным введением 40 мг / кг до 70 мг / кг пентобарбитала натрия. Убедитесь, мышь не достигает должного самолет анестезии, когда он не реагирует на твердую ног крайнем случае. Всегда проверяйте надлежащее обезболивание таким образом перед любой хирургической процедуры или вмешательства. Используйте смазки глазной мази, чтобы предотвратить сухость роговицы под наркозом. Обеспечение предоперационной анальгезии 2-4 ч до начала процедуры (бупренорфин 0,05 мг / кг SQ).
   1. Придерживаться последовательной асептики во время операции выживания. Внедрение процедур, которые препятствуют в максимально возможной степени микробной конзагрязне- таким образом, что значительное инфекции или нагноение не происходит. Эти процедуры включают в себя использование стерильных инструментов и стерильных материалов, обеззараживания операционного поля, а также удаление меха / волос над хирургического вмешательства и дезинфекции этом сайте.
2. Интубировать мышь с самостоятельной готовки притупляются 20-иглы.
   1. Положите мышь в положении лежа на спине с гиперэкстензии головы.
      1. Фокус свет на область шеи. Поднимите язык с закругленным pincet. Вход в гортань может быть хорошо видно.
      2. Pass ослабленный иглу через гортань в трахею под контролем зрения. Оценить правильность интубации при подключении мыши к вентилятору (ударного объема в мкл: 3 х масса тела (г) + 155; частота: 120 ударов в минуту).
   2. Кроме того, расширить границы визуализации интубации трахеи, сначала тщательно подвергая трахеи.
      1. Сделайте 5 мм в середине шеи разрез и убратьмышечная ткань чуть выше трахеи.
      2. Выполните интубации с помощью хирургического стереомикроскопом прямой визуализации трахеи. Поднимите язык и введите самостоятельное приготовление притупляются 20 иглы в трахею. Подтверждение правильности интубации при подключении мыши к вентилятору (ударного объема в мкл: 3 х масса тела (г) + 155; частота: 120 ударов в минуту).
3. Держите мышь в положении лежа на спине и закрепите мышь с лентой. Выполните операцию на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение.
   1. Бритье и дезинфицировать кожу Бетадин. Необходимо обеспечить, чтобы левой задних конечностей пересекает правую заднюю конечность, чтобы получить лучшее представление о левого желудочка во время операции.
4. Сделайте небольшой поперечный кожный разрез до грудины и отделить основную кожу и мышцы.
5. Потяните в сторону м. малая грудная мышца, т. грудная с 5-0 шелковой нити.
6. Согласовать Incision в третьем межреберье, вставив ослабленную pincet.
7. Перемещение pincet под межреберных мышц от боковых медиальной до достижения грудины. Прокол грудной стенки, нажав pincet изнутри к коже. Заполните торакотомия, тщательно резки межреберных мышц чуть выше pincet с небольшим ножницами. Используйте эту технику, чтобы предотвратить прокол легких.
8. Поместите губку, погруженную в 0,9% NaCl в полость для защиты легких. Введем раны распределитель (грудь втягивающего) в межреберье, чтобы получить воздействие на левой стороне сердца. В настоящее время, левое предсердие, левый желудочек, а левой передней нисходящей коронарной артерии видны под стереомикроскопа.
9. Выполнение лигирование левой передней нисходящей коронарной артерии с одним 6-0 проленовой лигатуры около 1 мм под кончиком левого предсердия. Это удалена от первой диагональной ветви.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, 7-0 (0Может быть использован 0,05 мм в диаметре) или 8-0 нитей (0,04 мм в диаметре). Игла C-1 13 мм 3/8 круга клиновые острие иглы. Успешное лигирование левой передней нисходящей коронарной артерии вызывает немедленное изменение цвета, в результате чего в виде бледно-появляющейся миокарда в пораженной территории.
10. Удалить раны удобрений (грудь втягивания).
    1. Поместите три 6-0 Ti-Cron швов вокруг межреберье. Перед затягиванием швов, удалите губкой из полости грудной клетки и вновь расширить легкие, блокируя отток вентилятора. Поступая таким образом, легкие воссоединиться с париетальной плевры.
    2. Впоследствии, потяните швы плотно и повторите повторного расширения, нажав на грудь. Подтверждения успешного закрытия грудной клетки с использованием небольшого количества физиологического раствора (пузырьки воздуха не должны рассматриваться при применении давления на грудную клетку).
    3. Посмотрите в межреберных мышц, чтобы подтвердить нормальное расширение легких. Повторно обе грудной мышцы, выступающей в качестведополнительная барьер для предотвращения пневмоторакса.
11. Закройте кожу с 5-0 шелковичных швов.
12. Отсоедините мышь от вентилятора и позволяют восстановления на грелку. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью выздоровел.
13. Последовательно обеспечить послеоперационное обезболивание (бупренорфин 0,05 мг кг SQ BID / по крайней мере 48 часов после операции).

2. В естественных условиях инвазивным Гемодинамические измерения у мышей

1. Перед процедурой, погрузить 1,0 французский катетер Millar давления в стерильной воде при 37 ° С в течение по меньшей мере 30 мин, чтобы свести к минимуму смещение сигнала. Электронно калибровку датчика давления на 0 мм рт 100 мм рт.ст. и записать данные в 2000 Гц.
2. Выполнение анестезии путем внутрибрюшинного введения 1,4 г / кг уретана. Убедитесь, чтомышь не достигает должного самолет анестезии, когда он не реагирует на твердую ног крайнем случае.
3. Поместите под наркозом мышь в положении лежа на спине. Безопасный свои конечности с лентой. Поддерживать температуру тела с грелку и монитор с прямой зонда. Бритье область шеи и сделать срединный разрез в области шеи, чтобы разоблачить щитовидной железы.
4. Закрепите шею погнутые иглы.
5. Потяните в сторону слюнной железы и выставить правильный общей сонной артерии. Блуждающий нерв, который напоминает белую нить, лежит вдоль артерии. Аккуратно отделите сонной артерии от блуждающего нерва с помощью изогнутых щипцов.
6. Пройти изогнутых щипцов под правой общей сонной артерии, чтобы отделить его от других тканей. Удалить соединительной ткани вокруг артерии.
7. Пропустите две 6-0 шёлковые провода под правой общей сонной артерии. Сделайте тугой узел на верхней сетке, которая находится к голове, закрыть, и исправить с Кохера (дистальной окклюзионной перевязки). Пропустите ProxiMAL проволока в два раза слева направо и зафиксировать 2 kochers (проксимальный негерметичная провод).
8. Держите сонной артерии влажный, понижая стерильный 0,9% NaCl. Вытрите лишнюю жидкость с ватными палочками.
9. Сделать надрез в правой общей сонной артерии с 26-калибровочной иглой между дистальной лигирования и проксимальной без окклюзионной проволоки.
10. Представьте датчик давления в артерии. Убедитесь, что нет потери крови. Осторожно вставьте 1,0 французский катетер Millar давления вперед и регулировать проксимальный без окклюзионные провод таким образом, что катетер может проходить тщательно через провод под ключицы.
    1. Свести к минимуму потери крови во время регулировки проксимального без окклюзионной проволоки. Не сжимать датчик давления слишком много при продвижении, так как он очень хрупкий. Поскольку проксимальный провод не должен закупоривать артерии, судно должно оставаться наполненный кровью.
11. Начало записи сигнала давления. Артериальная сигнал давления fluctuatES в здоровой мыши между диастолическим давлением 60 - 70 мм рт систолического давления 100 - 120 мм рт.
12. Прямой катетер через подвздошной артерии, и с помощью аорты в левый желудочек. Желудочка давление колеблется в пределах от 0 мм рт 100 - 120 мм рт. Разрешить катетер для стабилизации внутри левого желудочка. Записать сигнал в течение 30 мин до 60 мин в зависимости от требований эксперимента.
13. После завершения эксперимента, впитать катетер в Alconox 1% в течение 30 мин. Вымойте катетер с Milli-Q воды. Храните катетер в пеноблока.
14. Получение данных с помощью программного обеспечения записи для дальнейшего анализа.
    1. Для анализа данных, рассмотрим интервал времени, когда сигнал давления является стабильной. Выберите по крайней мере, 10 последовательных сердечных циклов записанных данных, представляющих интерес.
    2. Используйте LabChart программного обеспечения версии 8.0 или аналогичный анализ сердечного ритма, максимальное систолическое давления в левом желудочка, минимальный диастолическое левую ventricular давление, пиковая скорость в изоволюмического левого желудочка сжатия (DP / DT _макс), с пиковой скоростью от изоволюмического левого желудочка релаксации (DP / DT _мин), давления в левом желудочке конечного диастолического и постоянная времени изоволюмического левого желудочка Падение давления (тау) ^7.
       ПРИМЕЧАНИЕ: давление в конце диастолы соответствует давлению в момент времени непосредственно перед скачков давления, вызванного изоволюмического сокращения. Расчет тау основан на штуцер давления левого желудочка в кривую моноэкспоненциальный распада, выраженная в P _(T) = P ₀ ^е ~ ^{/ тау} + B В этой формуле Р _(Т) давления в левом желудочке во время т после максимального отрицательного значения DP / DT была достигнута. Параметр B соответствует теоретической асимптоты, который в упрощенном подходе можно считать равной нулю. Улучшенная изоволюмического релаксации приводит к меньшему значению тау.

Результаты

Степень инфаркта миокарда может быть оценена путем Эванс синий / хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC) двойного окрашивания. ТТС окислительно-восстановительный индикатор, который превращается в темно-красный 1,3,5-triphenylformazan в живых тканей из-за активности различных дегидрогеназ в присутст...

Обсуждение

Хронические изменения в структуры миокарда и функции, развитие дисфункции левого желудочка, и прогрессирование сердечной недостаточности могут быть исследованы в нескольких мышиных моделях ^12. Сердечный ремоделирование и дисфункцию могут быть вызваны повреждением миокарда ил?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Buprenorphine (Buprenex®)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal®)	Ceva
Betadine®	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Equipment
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3mm x 3mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.