La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Resumen

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Resumen

La insuficiencia cardíaca es un síndrome en el que el corazón deja de bombear sangre a un ritmo acorde con las necesidades de oxígeno celular en reposo o durante el estrés. Se caracteriza por la retención de líquidos, falta de aliento, y la fatiga, en particular en el esfuerzo. La insuficiencia cardiaca es un problema creciente de salud pública, la principal causa de hospitalización, y una causa importante de mortalidad. La cardiopatía isquémica es la principal causa de insuficiencia cardíaca.

Remodelación ventricular se refiere a cambios en la estructura, el tamaño, y la forma del ventrículo izquierdo. Esta remodelación arquitectónica del ventrículo izquierdo es inducida por lesión (por ejemplo, infarto de miocardio), por sobrecarga de presión (por ejemplo, hipertensión arterial sistémica o estenosis aórtica), o por sobrecarga de volumen. Desde la remodelación ventricular afecta el estrés de pared, tiene un profundo impacto en la función cardiaca y en el desarrollo de insuficiencia cardíaca. Un modelo de ligadura permanente de la descendin anterior izquierdag arteria coronaria en ratones se utiliza para investigar el remodelado ventricular y la función cardiaca después de un infarto de miocardio. Este modelo es fundamentalmente diferente en términos de objetivos y relevancia fisiopatológica en comparación con el modelo de la ligadura transitoria de la arteria descendente anterior coronaria. En este último modelo de lesión por isquemia / reperfusión, la medida inicial del infarto puede ser modulada por factores que afectan recuperación miocárdica después de la reperfusión. En contraste, la zona del infarto a las 24 horas después de la ligadura permanente de la arteria descendente anterior coronaria es fijo. La función cardiaca en este modelo se verá afectado por 1) el proceso de expansión del infarto, la curación del infarto, y la formación de cicatrices; y 2) el desarrollo concomitante de la dilatación ventricular izquierda, hipertrofia cardiaca, y remodelación ventricular.

Además del modelo de ligadura permanente de la arteria descendente anterior coronaria, la técnica de mea hemodinámica invasivamedicio- en ratones se presenta en detalle.

Introducción

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with the cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure¹.

Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. In other words, ventricular remodelling concerns an alteration of the left ventricular architecture. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload (e.g., mitral insufficiency). Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure.

Loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a decreased systolic ejection and an increased left ventricular end-diastolic volume and pressure. The Frank-Starling mechanism, implying that an increased end-diastolic volume results in an increased pressure developed during systole, may help to restore cardiac output. However, the concomitant increased wall stress may induce regional hypertrophy in the non-infarcted segment, whereas in the infarcted area expansion and thinning may occur. Experimental animal studies show that the infarcted ventricle hypertrophies and that the degree of hypertrophy is dependent on the infarct size².

The loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a sudden increase in loading conditions. Post-infarct remodelling occurs in the setting of volume overload, since the stretched and dilated infarcted tissue increases the left ventricular volume. An increased ventricular volume not only implies increased preload (passive ventricular wall stress at the end of diastole) but also increased afterload (total myocardial wall stress during systolic ejection). Afterload is increased since the systolic radius is increased. Therefore, ventricular remodelling post-myocardial infarction is characterized by mixed features of volume overload and pressure overload.

The myocardium consists of 3 integrated components: cardiomyocytes, extracellular matrix, and the capillary microcirculation. All 3 components are involved in the remodelling process. Matrix metalloproteinases produced by inflammatory cells induce degradation of intermyocyte collagen struts and cardiomyocyte slippage. This leads to infarct expansion characterized by the disproportionate thinning and dilatation of the infarct segment³. In later stages of remodelling, interstitial fibrosis is induced, which negatively affects the diastolic properties of the heart.

The vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium should remain balanced in the process of ventricular remodelling to avoid tissue hypoxia^4,5. Whether hypertrophy progresses to heart failure or not may be critically dependent on this balance between the vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium.

A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion⁶. In contrast, the infarct area at 24 hours after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos experimentales descritos en esta sección fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina Institucional (proyecto: 154/2013-B De Geest).

1. La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior

1. Anestesiar el ratón por administración intraperitoneal de 40 mg / kg a 70 mg / kg de pentobarbital sódico. Asegúrese de que el ratón llega su plano adecuado de anestesia cuando ya no reacciona una pizca dedo del pie firme. Siempre confirme anestesia adecuada de esta manera antes de cualquier procedimiento quirúrgico o intervención. Utilice lubricante pomada oftálmica para evitar la sequedad de la córnea, mientras que bajo anestesia. Proporcionar analgesia preoperatoria 2-4 hr antes del inicio del procedimiento (buprenorfina 0,05 mg / kg SQ).
   1. Aplicar las técnicas de asepsia consistentes durante la cirugía supervivencia. Implementar procedimientos que inhiben a un microbiana con máximo grado posiblecontaminación de modo que la infección o la supuración significativa no se produce. Estos procedimientos incluyen el uso de instrumentos estériles y materiales estériles, la desinfección del área quirúrgica y la eliminación de la piel / pelo sobre el sitio quirúrgico y desinfección de este sitio.
2. Intubar al ratón con una aguja roma de calibre 20 de elaboración propia.
   1. Ponga el ratón en posición supina con la hiperextensión de la cabeza.
      1. Enfocar la luz en la región del cuello. Levante la lengua con un pincet romo. La entrada de la laringe puede verse claramente.
      2. Pasar la aguja roma a través de la laringe dentro de la tráquea bajo visión directa. Evaluar la intubación correcta conectando el ratón para el ventilador (volumen sistólico en l: 3 x peso corporal (g) + 155; frecuencia: 120 golpes por minuto).
   2. Por otra parte, mejorar la visualización de la intubación endotraqueal exponiendo primero atentamente la tráquea.
      1. Hacer una incisión de 5 mm mediados de cuello y retraertejido muscular justo por encima de la tráquea.
      2. Realice la intubación usando un estereomicroscopio quirúrgico para la visualización directa de la tráquea. Levante la lengua e introduzca la aguja de calibre 20 auto-preparado embotado en la tráquea. Confirme intubación correcta conectando el ratón para el ventilador (volumen sistólico en l: 3 x peso corporal (g) + 155; frecuencia: 120 golpes por minuto).
3. Mantenga el ratón en posición supina y fijar el ratón con cinta. Realizar una cirugía en una almohadilla térmica para evitar la hipotermia.
   1. Afeitado y desinfectar la piel con Betadine. Tenga cuidado de que la extremidad posterior izquierda cruza la extremidad posterior derecha con el fin de obtener una vista mejor en el ventrículo izquierdo durante la cirugía.
4. Hacer una pequeña incisión cutánea transversal hasta el esternón y separar la piel y los músculos subyacentes.
5. Tire de lado el m. pectoral menor y m. pectoral mayor con una sutura de seda 5-0.
6. Hacer una incision en el tercer espacio intercostal mediante la inserción de un pincet romo.
7. Mueva el pincet debajo de los músculos intercostales de lateral a medial hasta que se alcanza el esternón. Perforar la pared torácica empujando el pincet desde el interior a la piel. Complete la toracotomía cortando cuidadosamente el músculo intercostal justo por encima del pincet con una pequeña tijera. Utilice esta técnica para evitar la perforación de los pulmones.
8. Ponga una esponja sumergida en 0,9% de NaCl en la cavidad para proteger los pulmones. Introducir un esparcidor de la herida (retractor pecho) en el espacio intercostal para obtener la exposición del lado izquierdo del corazón. A partir de ahora, la aurícula izquierda, el ventrículo izquierdo y la arteria descendente anterior coronaria son visibles bajo el microscopio estereoscópico.
9. Realice una ligadura de la arteria descendente anterior coronaria con un solo 6-0 prolene ligadura sobre 1 mm por debajo de la punta de la aurícula izquierda. Esto es distal de la primera rama diagonal.
   NOTA: Como alternativa, 7-0 (00,05 mm de diámetro) o 8-0 roscas (0,04 mm de diámetro) se pueden utilizar. La aguja es una aguja Point círculo Taper C-1 13 mm 3/8. Ligadura exitosa de la arteria descendente anterior coronaria induce decoloración inmediata, lo que resulta en un miocardio aparece pálido en el territorio afectado.
10. Retire el separador de la herida (retractor en el pecho).
    1. Coloque tres 6-0 suturas Ti-Cron alrededor del espacio intercostal. Antes de apretar las suturas, retire la esponja de la cavidad torácica y volver a expandir los pulmones mediante el bloqueo de la salida del ventilador. Al hacerlo, los pulmones se vuelven a conectar con la pleura parietal.
    2. Posteriormente, tirar de las suturas apretado y repetir reexpansión presionando hacia abajo en el pecho. Confirmar el cierre exitoso del tórax usando una pequeña cantidad de solución salina (no hay burbujas de aire deben considerarse cuando se aplica presión en el pecho).
    3. Mira a través del músculo intercostal confirmar expansión normal de los pulmones. Vuelva a colocar los dos músculos pectorales, que actúa como unbarrera adicional para la prevención de un neumotórax.
11. Cierre la piel con seda 5-0 suturas.
12. Desconecte el ratón del ventilador y permitir la recuperación sobre el cojín eléctrico. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
13. Constantemente proporcionar analgesia postoperatoria (buprenorfina 0,05 mg / kg BID SQ durante al menos 48 horas después de la cirugía).

2. En vivo hemodinámico invasivo Mediciones en ratones

1. Antes del procedimiento, sumergir el 1,0 francesa Millar catéter de presión en agua estéril a 37 ° C durante al menos 30 minutos para minimizar la deriva de la señal. Calibrar electrónicamente el sensor de presión a 0 mm Hg y 100 mm Hg y registrar datos en 2000 Hz.
2. Realizar la anestesia mediante la administración intraperitoneal de 1,4 g / kg de uretano. Compruebe queel ratón llega a su plano adecuado de anestesia cuando ya no reacciona una pizca dedo del pie firme.
3. Coloca el ratón anestesiado en posición supina. Asegure sus extremidades con cinta adhesiva. Mantenga la temperatura del cuerpo con una almohadilla térmica y monitor con una sonda rectal. Afeitarse la región del cuello y hacer una incisión en la línea media en la región del cuello para exponer la glándula tiroides.
4. Fijar el cuello con agujas dobladas.
5. Tire de un lado de la glándula salival y exponer la arteria carótida común derecha. El nervio vago, que se asemeja a un hilo blanco, se encuentra a lo largo de la arteria. Separe con cuidado la arteria carótida del nervio vago usando unas pinzas curvas.
6. Pasar un pinzas curvas debajo de la arteria carótida común derecha para separarlo de otros tejidos. Quitar el tejido conectivo alrededor de la arteria.
7. Pasar dos 6-0 cables de seda debajo de la arteria carótida común derecha. Hacer un nudo apretado en el alambre superior, que se coloca a la cabeza, cerrar y fijar con un Kocher (ligadura distal oclusiva). Pase el proxialambre mal dos veces de izquierda a derecha y fijar con 2 kochers (alambre no oclusiva proximal).
8. Mantenga la arteria carótida húmedo dejando caer un 0,9% de NaCl estéril. Seque el exceso de líquido con bastoncillos de algodón.
9. Hacer una incisión en la arteria carótida común derecha con una aguja de calibre 26 entre la ligadura distal y el alambre no oclusivo proximal.
10. Introducir el sensor de presión en la arteria. Verifique que no hay pérdida de sangre. Empuje suavemente el catéter de presión Millar 1.0 French adelante y ajustar el alambre no oclusiva proximal de tal manera que el catéter puede pasar cuidadosamente a través del cable por debajo de la clavícula.
    1. Minimizar la pérdida de sangre durante el ajuste del alambre no oclusivo proximal. No comprima el sensor de presión demasiado mientras avanzaba ya que es muy frágil. Como el hilo proximal no debe ocluir la arteria, el recipiente debe permanecer llena de sangre.
11. Comience a grabar la señal de presión. Una señal de la presión arterial fluctuates en un ratón sano entre una presión diastólica de 60 a 70 mm Hg y una presión sistólica de 100 a 120 mm Hg.
12. Dirigir el catéter a través de la arteria innominada y a través de la aorta hacia el ventrículo izquierdo. La presión ventricular fluctúa entre 0 mm Hg y 100 a 120 mm Hg. Permitir que el catéter se estabilice el interior del ventrículo izquierdo. Grabar la señal durante 30 min a 60 min dependiendo de los requisitos experimentales.
13. Después de la terminación del experimento, en remojo el catéter en Alconox 1% durante 30 min. Lave el catéter con agua Milli-Q. Guarde el catéter en un bloque de espuma.
14. Recuperar datos del software de grabación para su posterior análisis.
    1. Para el análisis de datos, tenga en cuenta un intervalo de tiempo en que la señal de presión es estable. Elija por lo menos 10 ciclos cardíacos consecutivos de los datos registrados de interés.
    2. Utilice software LabChart versión 8.0 o similar para analizar el ritmo cardíaco, la presión sistólica izquierda presión ventricular máxima, la mínima ventr izquierda diastólicapresión icular, la tasa pico de la contracción isovolumétrica ventricular izquierda (dP / dt _max), la tasa pico de la relajación isovolumétrica ventricular izquierda (dP / dt _min), la presión ventricular izquierda diastólica final, y la constante de tiempo de la ventricular izquierda isovolumétrica caída de presión (tau) ^7.
       NOTA: La presión diastólica final corresponde a la presión en el punto de tiempo inmediatamente antes del aumento de la presión inducida por la contracción isovolumétrica. El cálculo de tau se basa en el ajuste de la presión ventricular izquierda en una curva de decaimiento monoexponencial, expresado como P _(t) = p ₀ e ^{-t / tau} + b, En esta fórmula, P _(t) es la presión ventricular izquierda en el momento se ha llegado a t después de que el valor negativo máximo de dP / dt. El parámetro b corresponde a la asíntota teórico, que en un enfoque simplificado se puede suponer que es cero. Relajación isovolumétrica mejorada se traduce en un valor más pequeño de tau.

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Resultados

El grado de infarto de miocardio puede ser evaluada por azul de Evans / cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) doble tinción. TTC es un indicador redox, que se convierte en 1,3,5-triphenylformazan-rojo profundo en los tejidos debido a la actividad de diversas deshidrogenasas en presencia de NADH ⁸ viviente. La figura 1 muestra una sección representativa del corazón a las 24 horas después de la ligadura de la arteria descendente anterior coronaria. Zonas azules manchados indican regione...

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Discusión

Cambios crónicos en la estructura y la función miocárdica, el desarrollo de la disfunción ventricular izquierda, y la progresión a la insuficiencia cardíaca pueden ser investigados en varios modelos murinos ^12. La remodelación cardiaca y la disfunción puede ser inducida por lesión miocárdica o por sobrecarga de presión secundaria a la constricción de la aorta transversal, o pueden ser investigados en modelos genéticos de la miocardiopatía dilatada ^12. Obviamente, el beneficio más pro...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine (Buprenex)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal)	Ceva
Betadine	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7 cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3 mm x 3 mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.