Legatura permanente dell'arteria discendente anteriore sinistra coronarica nei topi: un modello di post-infarto rimodellante miocardico e insufficienza cardiaca

Riepilogo

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Abstract

L'insufficienza cardiaca è una sindrome in cui il cuore non riesce a pompare il sangue ad una velocità al fabbisogno di ossigeno cellulari a riposo o durante lo stress. E 'caratterizzata da ritenzione di liquidi, mancanza di respiro, e la fatica, in particolare da sforzo. Lo scompenso cardiaco è un problema crescente di salute pubblica, la principale causa di ospedalizzazione, e una delle principali cause di mortalità. Cardiopatia ischemica è la principale causa di insufficienza cardiaca.

Rimodellamento ventricolare riferisce alle variazioni di struttura, la dimensione e la forma del ventricolo sinistro. Questo rimodellamento architettonica del ventricolo sinistro è indotta da lesioni (es, infarto del miocardio), da sovraccarico di pressione (per esempio, ipertensione arteriosa sistemica o stenosi aortica), o da sovraccarico di volume. Dal rimodellamento ventricolare colpisce stress di parete, ha un profondo impatto sulla funzione cardiaca e sullo sviluppo di insufficienza cardiaca. Un modello di legatura permanente del descendin anteriore sinistrag coronarica nei topi è utilizzato per studiare il rimodellamento ventricolare e della funzione cardiaca dopo infarto miocardico. Questo modello è fondamentalmente diverso in termini di obiettivi e di rilevanza fisiopatologica rispetto al modello di legatura transitoria della discendente anteriore dell'arteria coronaria. In questo secondo modello di danno da ischemia / riperfusione, la portata iniziale dell'infarto può essere modulata da fattori che influenzano salvataggio miocardico seguente riperfusione. Al contrario, l'area infartuata a 24 ore dopo la legatura permanente della discendente anteriore dell'arteria coronaria è fisso. La funzione cardiaca in questo modello sarà influenzato dal 1) il processo di espansione infarto, infarto guarigione, e la formazione di cicatrici; e 2) lo sviluppo concomitante di dilatazione del ventricolo sinistro, ipertrofia cardiaca, e rimodellamento ventricolare.

Oltre il modello di legatura permanente della discendente anteriore dell'arteria coronaria, la tecnica invasiva emodinamico meamisura- nei topi è presentato in dettaglio.

Introduzione

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with the cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure¹.

Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. In other words, ventricular remodelling concerns an alteration of the left ventricular architecture. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload (e.g., mitral insufficiency). Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure.

Loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a decreased systolic ejection and an increased left ventricular end-diastolic volume and pressure. The Frank-Starling mechanism, implying that an increased end-diastolic volume results in an increased pressure developed during systole, may help to restore cardiac output. However, the concomitant increased wall stress may induce regional hypertrophy in the non-infarcted segment, whereas in the infarcted area expansion and thinning may occur. Experimental animal studies show that the infarcted ventricle hypertrophies and that the degree of hypertrophy is dependent on the infarct size².

The loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a sudden increase in loading conditions. Post-infarct remodelling occurs in the setting of volume overload, since the stretched and dilated infarcted tissue increases the left ventricular volume. An increased ventricular volume not only implies increased preload (passive ventricular wall stress at the end of diastole) but also increased afterload (total myocardial wall stress during systolic ejection). Afterload is increased since the systolic radius is increased. Therefore, ventricular remodelling post-myocardial infarction is characterized by mixed features of volume overload and pressure overload.

The myocardium consists of 3 integrated components: cardiomyocytes, extracellular matrix, and the capillary microcirculation. All 3 components are involved in the remodelling process. Matrix metalloproteinases produced by inflammatory cells induce degradation of intermyocyte collagen struts and cardiomyocyte slippage. This leads to infarct expansion characterized by the disproportionate thinning and dilatation of the infarct segment³. In later stages of remodelling, interstitial fibrosis is induced, which negatively affects the diastolic properties of the heart.

The vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium should remain balanced in the process of ventricular remodelling to avoid tissue hypoxia^4,5. Whether hypertrophy progresses to heart failure or not may be critically dependent on this balance between the vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium.

A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion⁶. In contrast, the infarct area at 24 hours after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sperimentali descritte in questa sezione sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato consultivo di ricerca della Katholieke Universiteit Leuven istituzionale (Progetto: 154/2013-B De Geest).

1. permanente legatura dell'arteria coronarica discendente anteriore sinistra

1. Anestetizzare il mouse per somministrazione intraperitoneale di 40 mg / kg a 70 mg / kg di sodio pentobarbital. Assicurarsi che il mouse raggiunge il suo corretto piano di anestesia quando non reagisce più un pizzico punta ditta. Verificare sempre la corretta anestesia questo modo prima di qualsiasi procedura chirurgica o intervento. Utilizzare lubrificante pomata oftalmica per prevenire la secchezza della cornea mentre sotto anestesia. Fornire analgesia preoperatoria 2-4 ore prima dell'inizio della procedura (buprenorfina 0,05 mg / kg SQ).
   1. Applicare tecniche asettiche coerenti durante l'intervento chirurgico la sopravvivenza. Implementare procedure che inibiscono un con microbica massimo possibile misuracontaminazione in modo che l'infezione significativo o suppurazione non si verifica. Queste procedure includono l'uso di strumenti sterili e materiali sterili, disinfezione dell'area chirurgica, e la rimozione di pelliccia / capelli sopra il sito chirurgico e la disinfezione di questo sito.
2. Intubare il mouse con un smussato ago 20-gauge auto-preparata.
   1. Ponga il mouse in posizione supina con iperestensione del capo.
      1. Focalizzare la luce sulla regione del collo. Sollevare la lingua con un pincet smussata. L'ingresso della laringe può essere visto chiaramente.
      2. Passare l'ago smussato attraverso la laringe nella trachea sotto visione diretta. Valutare corretta intubazione collegando il mouse per il ventilatore (stroke volume in microlitri: 3 x peso corporeo (g) + 155; Frequenza: 120 colpi al minuto).
   2. In alternativa, migliorare la visualizzazione di intubazione endotracheale esponendo con la massima attenzione la trachea.
      1. Fare un 5 millimetri un'incisione mid-collo e ritrarretessuto muscolare appena sopra la trachea.
      2. Eseguire l'intubazione utilizzando uno stereomicroscopio chirurgica per la visualizzazione diretta della trachea. Sollevare la lingua e inserire la calibro 20 ago auto-preparata smussato nella trachea. Confermare corretta intubazione collegando il mouse per il ventilatore (stroke volume in microlitri: 3 x peso corporeo (g) + 155; Frequenza: 120 colpi al minuto).
3. Tenere il mouse in posizione supina e fissare il mouse con nastro. Eseguire un intervento chirurgico su una piastra elettrica per evitare l'ipotermia.
   1. Shave e disinfettare la pelle con Betadine. Assicurarsi che l'arto posteriore sinistra attraversa destra dell'arto posteriore al fine di ottenere una migliore visualizzazione sul ventricolo sinistro durante l'intervento chirurgico.
4. Fai una piccola incisione cutanea trasversale fino allo sterno e separare la pelle ed i muscoli sottostanti.
5. Estrarre da parte la m. piccolo pettorale e m. pettorale con una sutura 5-0 seta.
6. Fai incision nel terzo spazio intercostale inserendo un pincet smussata.
7. Spostare il pincet sotto i muscoli intercostali da laterale a mediale fino a raggiungere lo sterno. Perforare la parete toracica spingendo la pincet dall'interno alla pelle. Completare la toracotomia tagliando attentamente il muscolo intercostale appena sopra il pincet con una piccola forbice. Utilizzare questa tecnica per impedire punzonamento dei polmoni.
8. Mettere una spugna immersa in 0,9% NaCl nella cavità per proteggere i polmoni. Introdurre un spreader ferita (riavvolgitore petto) nello spazio intercostale per ottenere esposizione del lato sinistro del cuore. A partire da ora, l'atrio sinistro, il ventricolo sinistro, e la discendente anteriore sinistra coronarica sono visibili con lo stereomicroscopio.
9. Eseguire una legatura della discendente anteriore dell'arteria coronaria con un'unica 6-0 prolene legatura di circa 1 mm sotto la punta dell'atrio sinistro. Questo è distale dal primo ramo diagonale.
   NOTA: In alternativa, 7-0 (0Possono essere utilizzati .05 mm di diametro) o 8-0 fili (0,04 mm di diametro della). L'ago è un cerchio Taper Point ago C-1 13 millimetri 3/8. Legatura successo della discendente anteriore dell'arteria coronaria induce scolorimento immediata, risultando in un miocardio appare pallida nel territorio interessato.
10. Rimuovere la spreader ferita (divaricatore petto).
    1. Mettere tre 6-0 suture Ti-Cron intorno spazio intercostale. Prima di serrare le suture, rimuovere la spugna dalla cavità toracica e ri-expand polmoni bloccando il deflusso del ventilatore. In questo modo, i polmoni riconnettersi con la pleura parietale.
    2. Successivamente, tirare le suture stretto e ripetere riespansione premendo sul petto. Conferma la chiusura successo del torace utilizzando una piccola quantità di soluzione salina (bolle d'aria devono essere considerate quando si applica pressione sul torace).
    3. Guardare attraverso il muscolo intercostale per confermare normale dilatazione dei polmoni. Riposizionare entrambi i muscoli pettorali, che serve come unulteriore ostacolo per la prevenzione di un pneumotorace.
11. Chiudere la pelle con 5-0 seta-suture.
12. Scollegare il mouse dal ventilatore e consentire il recupero sulla piastra elettrica. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
13. Coerentemente fornire analgesia postoperatoria (buprenorfina 0,05 mg / kg SQ BID per almeno 48 ore dopo l'intervento chirurgico).

2. In vivo Misure Invasive emodinamici nei topi

1. Prima della procedura, immergere Francese Millar catetere pressione 1,0 in acqua sterile a 37 ° C per almeno 30 minuti per ridurre la deriva del segnale. Elettronicamente calibrare il sensore di pressione a 0 mmHg e 100 mmHg e registrare i dati a 2.000 Hz.
2. Eseguire anestesia mediante somministrazione intraperitoneale di 1,4 g / kg uretano. Controllare cheil mouse raggiunge il suo corretto piano di anestesia quando non reagisce più un pizzico punta ditta.
3. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina. Fissare le sue membra con nastro adesivo. Mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica e monitorare con una sonda rettale. Shave regione del collo e fare una incisione mediana nella regione del collo per esporre la ghiandola tiroidea.
4. Fissare il collo con aghi piegati.
5. Estrarre da parte delle ghiandole salivari e esporre il diritto carotide comune. Il nervo vago, che assomiglia a un filo bianco, si trova lungo l'arteria. Separare con cautela la carotide dal nervo vago con una pinza curva.
6. Passare una pinza curvo sotto il diritto carotide comune per separarla da altri tessuti. Rimuovere tessuto connettivo attorno l'arteria.
7. Passare due 6-0 fili di seta sotto il diritto carotide comune. Fare un nodo stretto sul filo superiore, che si trova verso la testa, stretta, e fissare con un Kocher (occlusiva legatura distale). Passare il Proxifilo mal due volte da sinistra a destra e fissare con 2 Kochers (fili non occlusiva prossimale).
8. Mantenere la carotide umido facendo cadere sterile 0,9% NaCl. Asciugare il liquido in eccesso con bastoncini di cotone.
9. Fare un'incisione nella giusta carotide comune con un ago calibro 26 tra la legatura distale e il filo non-occlusiva prossimale.
10. Introdurre il sensore di pressione nell'arteria. Verificare che non vi è alcuna perdita di sangue. Spingere delicatamente Francese Millar catetere pressione 1.0 avanti e regolare il filo non-occlusiva prossimale in modo tale che il catetere può passare attentamente il cavo sotto la clavicola.
    1. Ridurre al minimo la perdita di sangue durante la regolazione del filo non occlusiva prossimale. Non comprimere il sensore di pressione troppo mentre avanza poiché è molto fragile. Poiché il filo prossimale non deve occludere l'arteria, la nave deve rimanere pieno di sangue.
11. Avviare la registrazione del segnale di pressione. Un segnale di pressione arteriosa Fluctuates in un sano mouse tra una pressione diastolica a 60 - 70 mmHg e una pressione sistolica di 100 - 120 mm Hg.
12. Dirigere il catetere attraverso l'arteria anonima e tramite l'aorta nel ventricolo sinistro. La pressione ventricolare oscilla tra 0 mm Hg e 100 - 120 mm Hg. Lasciare il catetere per stabilizzare all'interno del ventricolo sinistro. Registrare il segnale per 30 min a 60 min a seconda delle esigenze sperimentali.
13. Dopo il completamento dell'esperimento, immergere il catetere in Alconox 1% per 30 min. Lavare il catetere con acqua Milli-Q. Conservare il catetere in un blocco di schiuma.
14. Recuperare i dati del software di registrazione per ulteriori analisi.
    1. Per l'analisi dei dati, si consideri un intervallo di tempo in cui il segnale di pressione è stabile. Scegli almeno 10 cicli cardiaci consecutivi dei dati registrati di interesse.
    2. Utilizzare LabChart software versione 8.0 o simile per analizzare la frequenza cardiaca, la massima sistolica sinistra pressione ventricolare, il minimo ventr diastolica sinistraicular pressione, la velocità di picco di isovolumica contrazione ventricolare sinistra (dP / dt _max), la velocità di picco di isovolumica rilassamento ventricolare sinistra (dP / dt _min), la pressione ventricolare sinistra telediastolica, e la costante di tempo del ventricolo sinistro isovolumica caduta di pressione (tau) ^7.
       NOTA: La pressione telediastolica corrisponde alla pressione al momento punto immediatamente prima l'aumento della pressione indotta dalla contrazione isovolumica. Il calcolo di tau è basato sul montaggio della pressione ventricolare sinistra in una curva di decadimento monoesponenziale, espressa come P _(t) = p ₀ e ^{-t / tau} + b, In questa formula, P _(t) è la pressione ventricolare sinistra al momento t dopo il valore negativo massimo di dP / dt è stato raggiunto. Il parametro b corrisponde al asintoto teorica, che in un approccio semplificato può essere assunto pari a zero. Maggiore relax isovolumica traduce in un valore più piccolo di tau.

Risultati

L'estensione di infarto del miocardio può essere valutata Evans blue / cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) doppia colorazione. TTC è un indicatore redox, che viene convertito in rosso scuro 1,3,5-triphenylformazan nei tessuti a causa della attività di vari deidrogenasi in presenza di NADH ⁸ vivente. La Figura 1 mostra una sezione rappresentativa del cuore a 24 ore dopo legatura del discendente anteriore dell'arteria coronaria. Aree blu macchiato indicano regioni non-ischemich...

Discussione

Cambiamenti cronici nella struttura e funzione miocardica, lo sviluppo di disfunzione ventricolare sinistra, e la progressione di insufficienza cardiaca possono essere studiati in diversi modelli murini ^12. Rimodellamento cardiaco e disfunzione può essere indotta da un danno miocardico o da pressioni sovraccaricare secondaria trasversale costrizione aortica, o possono essere studiati in modelli genetici di cardiomiopatia dilatativa ^12. Ovviamente, il beneficio più pronunciato dei modelli murini ?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Buprenorphine (Buprenex®)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal®)	Ceva
Betadine®	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Equipment
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3mm x 3mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.