קשירת קבע של העורק השמאלי קדמי יורד כלילית בעכברים: דגם של Remodelling אוטם שריר לב ופוסט-אי ספיקת לב

Summary

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Abstract

אי ספיקת לב היא תסמונת שבו הלב אינו מצליח לשאוב דם בקצב אחד עם דרישות חמצן סלולריות במנוחה או בלחץ. הוא מאופיין על ידי אגירת נוזלים, קוצר נשימה, ועייפות, בפרט על מאמץ. אי ספיקת לב היא בעיה גוברת בריאות הציבור, הגורם המוביל לאשפוז, ואחד גורמים עיקריים לתמותה. מחלת לב איסכמית היא הגורם העיקרי לאי ספיקת לב.

שיפוץ של חדר מתייחס לשינויים במבנה, גודל, וצורה של החדר השמאלי. שיפוץ אדריכלי זה של החדר השמאלי הוא מושרה על ידי פגיעה (למשל, אוטם שריר לב), על ידי עומס יתר לחץ (למשל, יתר לחץ דם או היצרות של אב העורקים), או על ידי עומס נפח. מאז שיפוץ של החדר משפיע על קיר לחץ, יש לו השפעה עמוקה על תפקוד לב ועל ההתפתחות של אי ספיקת לב. מודל של קשירת קבע של descendin הקדמי השמאליעורקים הכליליים g בעכברים משמש לחקור שיפוץ של חדר ואוטם שריר לב לאחר תפקוד לב. מודל זה שונה במהותו במונחים של יעדים ואת הרלוונטיות של pathophysiological בהשוואה למודל של קשירה החולפת של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת. במודל השני זה של פציעת איסכמיה / reperfusion, המידה הראשונית של האוטם יכולה להיות מווסתת על ידי גורמים המשפיעים על הצלה שריר לב לאחר reperfusion. בניגוד לכך, אזור האוטם ב 24 שעות לאחר קשירת קבע של קדמי עורק הכלל השמאלי היורדת הוא קבוע. תפקוד לב במודל זה יושפע 1) התהליך של התרחבות אוטם, ריפוי אוטם, והיווצרות צלקת; ו 2) הפיתוח הנלווה של התרחבות חדר השמאלית, היפרטרופיה של הלב, ושיפוץ של חדר.

חוץ מזה המודל של קשירת קבע של קדמי עורק הכלל השמאלי היורד, הטכניקה של mea hemodynamic פולשניתsurements בעכברים מוצג בפירוט.

Introduction

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with the cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure¹.

Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. In other words, ventricular remodelling concerns an alteration of the left ventricular architecture. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload (e.g., mitral insufficiency). Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure.

Loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a decreased systolic ejection and an increased left ventricular end-diastolic volume and pressure. The Frank-Starling mechanism, implying that an increased end-diastolic volume results in an increased pressure developed during systole, may help to restore cardiac output. However, the concomitant increased wall stress may induce regional hypertrophy in the non-infarcted segment, whereas in the infarcted area expansion and thinning may occur. Experimental animal studies show that the infarcted ventricle hypertrophies and that the degree of hypertrophy is dependent on the infarct size².

The loss of myocardial tissue following acute myocardial infarction results in a sudden increase in loading conditions. Post-infarct remodelling occurs in the setting of volume overload, since the stretched and dilated infarcted tissue increases the left ventricular volume. An increased ventricular volume not only implies increased preload (passive ventricular wall stress at the end of diastole) but also increased afterload (total myocardial wall stress during systolic ejection). Afterload is increased since the systolic radius is increased. Therefore, ventricular remodelling post-myocardial infarction is characterized by mixed features of volume overload and pressure overload.

The myocardium consists of 3 integrated components: cardiomyocytes, extracellular matrix, and the capillary microcirculation. All 3 components are involved in the remodelling process. Matrix metalloproteinases produced by inflammatory cells induce degradation of intermyocyte collagen struts and cardiomyocyte slippage. This leads to infarct expansion characterized by the disproportionate thinning and dilatation of the infarct segment³. In later stages of remodelling, interstitial fibrosis is induced, which negatively affects the diastolic properties of the heart.

The vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium should remain balanced in the process of ventricular remodelling to avoid tissue hypoxia^4,5. Whether hypertrophy progresses to heart failure or not may be critically dependent on this balance between the vascular and cardiomyocyte compartment in the myocardium.

A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion⁶. In contrast, the infarct area at 24 hours after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.

Protocol

הערה: כל הליכי הניסוי מתוארים בסעיף זה אושרו על ידי מוסדי טיפול בבעלי חי הוועדה המייעצת מחקר של Katholieke Universiteit לובן (הפרויקט: 154/2013-B De גיסט).

1. קשירת קבע של העורק השמאלי קדמי יורד כלילית

1. להרדים את העכבר על ידי ממשל intraperitoneal של 40 מ"ג / קילוגרם עד 70 מ"ג / קילוגרם של נתרן pentobarbital. להבטיח את העכבר מגיע מטוסו הראוי לו הרדמה כשזה כבר לא מגיב קמצוץ הבוהן חברה. תמיד לאשר הרדמה נכונה בדרך זו לפני כל הליך או התערבות כירורגית. השתמש בסיכת משחת עיניים כדי למנוע יובש של הקרנית ואילו בהרדמה. לספק שיכוך כאבים לפני ניתוח 2-4 שעות לפני תחילת ההליך (0.05 מ"ג / קילוגרם SQ עצירות).
   1. ליישם טכניקות ספטית עקביות במהלך ניתוח הישרדות. ליישם נהלים המעכבים לcon חיידקים מקסימאלי במידת האפשרtamination כך שזיהום או הִתמַגְלוּת משמעותיים אינו מתרחש. נהלים אלה כוללים שימוש בכלים סטריליים וחומרים סטריליים, חיטוי אזור הניתוח, והסרת פרווה / שיער על האתר והחיטוי כירורגית של אתר זה.
2. צנרר העכבר עם מחט 20-מד הקהה הכנה עצמית.
   1. שים את העכבר במצב שכיבה עם hyperextension של הראש.
      1. למקד את האור על אזור הצוואר. הרם את הלשון עם pincet קהה. הכניסה לגרון ניתן לראות בבירור.
      2. להעביר את המחט הקהה דרך הגרון לתוך קנה הנשימה תחת ראייה ישירה. להעריך אינטובציה הנכונה על ידי חיבור העכבר להנשמה (נפח פעימה בμl: 3 x משקל גוף (ז) 155 +; תדירות: 120 פעימות לדקה).
   2. לחלופין, לשפר את ההדמיה של אינטובציה endotracheal ידי חשיפת קנה הנשימה הראשונה בזהירות.
      1. לעשות חתך באמצע צוואר-5 מ"מ ולחזור בירקמת שריר שמעל קנה הנשימה.
      2. לבצע אינטובציה באמצעות סטראו כירורגית להדמיה ישירה של קנה הנשימה. הרם את הלשון והזן את מחט 20 מד-הכנה העצמית הקהה לתוך קנה הנשימה. לאשר אינטובציה הנכונה על ידי חיבור העכבר להנשמה (נפח פעימה בμl: 3 x משקל גוף (ז) 155 +; תדירות: 120 פעימות לדקה).
3. שמור את העכבר במצב שכיבה ולתקן את העכבר עם קלטת. לבצע ניתוח על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה.
   1. לגלח ולחטא את העור עם פולידין. דואג שהאיבר האחורי השמאלי חוצה את הגפיים אחוריות ימין על מנת לקבל מבט טוב יותר על החדר השמאלי במהלך ניתוח.
4. לעשות חתך רוחבי עורית קטן עד עצם החזה ולהפריד את העור ושרירים שמתחת.
5. מסיט מ '. קטין pectoralis ומטר. pectoralis גדול עם תפר 5-0 משי.
6. תן ליncision בחלל הצלע השלישי על ידי החדרת pincet קהה.
7. הזז את pincet תחת השרירים הבין- מהרוחב המדיאלי עד שיגיע לעצם החזה. לנקב את קיר בית החזה על ידי לחיצה על pincet מבפנים לעור. השלם את פתיחת בית החזה על ידי חיתוך בזהירות את השרירים צלעי בדיוק מעל pincet עם מספריים קטנים. להשתמש בטכניקה זו כדי למנוע ניקוב של הריאות.
8. שים ספוג טבול בשיעור של 0.9% NaCl לתוך החלל כדי להגן על הריאות. להציג את מפזר פצע (מפשק חזה) אל תוך חלל הצלע להשיג חשיפה של הצד השמאלי של הלב. נכון לעכשיו, הפרוזדור השמאלי, החדר השמאלי, וקדמי עורק הכלל השמאלי יורדות נראה בסטראו.
9. לבצע קשירה של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת עם מייתר 6-0 prolene אחת על 1 מ"מ מתחת לקצה הפרוזדור השמאלי. זה דיסטלי מהסניף האלכסוני הראשון.
   הערה: לחלופין, 7-0 (0.05 מ"מ קוטר) או 8-0 אשכולות (0.04 מ"מ קוטר) ניתן להשתמש. המחט היא מחט נקודת פיד המעגל C-1 13 מ"מ 3/8. קשירה מוצלחת של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת גורמת שינוי צבע מיידי, וכתוצאה מכך שריר לב מופיע חיוור בשטח המושפע.
10. הסר את מפזר הפצע (מפשק חזה).
    1. הנח שלושה 6-0 תפרי Ti-Cron סביב חלל הצלע. לפני הידוק התפרים, להסיר את הספוג מחלל החזה ומחדש להרחיב את הריאות על ידי חסימת יצוא של מכונת ההנשמה. בעשותם כך, הריאות להתחבר עם אדר הקודקודית.
    2. בהמשך לכך, למשוך את החוט חזק מדי ולחזור מחדש הרחבה על ידי לחיצה על החזה. לאשר את הסגירה המוצלחת של בית החזה באמצעות כמות קטנה של מלח (אין בועות אוויר יש לראות בעת הפעלה לחץ על החזה).
    3. תראה דרך שריר הצלע כדי לאשר הרחבה נורמלית של הריאות. למקם שני שרירי בית החזה, המשמש כמחסום נוסף למניעת pneumothorax.
11. סגור את העור עם 5-0 משי-תפרים.
12. נתק את העכבר ממכונת ההנשמה ולאפשר התאוששות בכרית החימום. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין.
13. באופן עקבי לספק שיכוך כאבים לאחר ניתוח (0.05 מ"ג / קילוגרם SQ BID עצירות לפחות 48 שעות לאחר ניתוח).

2. מדידות פולשנית המודינמית בvivo בעכברים

1. לפני ההליך, להטביע את צנתר הלחץ הצרפתי מילר 1.0 במים סטריליים על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות כדי למזער להיסחף אות. באופן אלקטרוני לכייל את חיישן לחץ ב0 מ"מ כספית ו -100 מ"מ כספית ונתונים שיא ב 2000 הרץ.
2. לבצע הרדמה על ידי ממשל intraperitoneal של 1.4 גר '/ קילוגרם urethane. בדוק שהעכבר מגיע מטוסו הראוי לו הרדמה כשזה כבר לא מגיב קמצוץ הבוהן חברה.
3. מניחים את העכבר מורדם במצב שכיבה. Secure הגפיים שלו עם קלטת. לשמור על טמפרטורת גוף עם כרית חימום ולפקח עם בדיקה רקטלית. לגלח את אזור הצוואר ולעשות חתך קו האמצע באזור הצוואר כדי לחשוף את בלוטת התריס.
4. תקן את הצוואר עם מחטים כפופות.
5. מסיט הצידה את בלוטת הרוק ולחשוף את עורק התרדמה המשותף תקין. העצב התועה, שדומה חוט לבן, שוכן לאורך העורק. בזהירות להפריד את העורק הראשי מהעצב התועה באמצעות מלקחיים מעוקלים.
6. לעבור מלקחיים מעוקלים תחת עורק התרדמה משותפת הזכות להפריד אותו מרקמות אחרות. הסרה של רקמת חיבור סביב העורק.
7. עובר שני חוטי משי 6-0 תחת עורק התרדמה המשותף תקין. הפוך קשר הדוק על החוט העליון, אשר ממוקם לכיוון הראש, הקרוב, ולתקן עם (קשירה אוטמת דיסטלי) Kocher. להעביר את Proxiחוט mal פעמיים משמאל לימין ולתקן עם 2 kochers (חוט שאינו אוטם פרוקסימלי).
8. שמור את העורק הראשי לח על ידי הטלת 0.9% NaCl סטרילי. לייבש את הנוזל עודף עם ניצני כותנה.
9. עושה חתך בעורק התרדמה המשותף תקין עם מחט 26-מד בין קשירת דיסטלי והחוט שאינו אוטם הפרוקסימלי.
10. להציג את חיישן הלחץ לתוך העורק. ודא שאין איבוד דם. דחף בעדינות את הקטטר הלחץ הצרפתי מילר 1.0 קדימה ולהתאים את החוט שאינו אוטם הפרוקסימלי באופן כזה שקטטר יכול לעבור בזהירות דרך החוט מתחת לעצם הבריח.
    1. להקטין את איבוד דם במהלך ההתאמה של החוט שאינו אוטם הפרוקסימלי. לא לדחוס את חיישן לחץ רב מדי תוך קידום מאז שזה מאוד שביר. מאז החוט הפרוקסימלי אסור לחסום את העורק, הכלי צריך להישאר מלא בדם.
11. להתחיל להקליט את אות הלחץ. Fluctuat אות לחץ דםes בעכבר בריא בין לחץ הדיאסטולי של 60 - 70 מ"מ כספית ולחץ הסיסטולי של 100 - 120 מ"מ כספית.
12. כוון את הצנתר דרך עורק innominate ודרך אב העורקים לתוך החדר השמאלי. הלחץ של החדר נע בין 0 מ"מ כספית ו100-120 מ"מ כספית. לאפשר לקטטר כדי לייצב בתוך החדר השמאלי. רשום את האות למשך 30 דקות עד 60 דקות בהתאם לדרישות הניסוי.
13. לאחר השלמת הניסוי, להשרות את הצנתר ב% 1 Alconox למשך 30 דקות. שטוף את הקטטר עם מים מילי- Q. אחסן את הצנתר בתוך גוש קצף.
14. אחזור נתונים מהתוכנה ההקלטה לניתוח נוסף.
    1. לניתוח נתונים, לשקול מרווח זמן שבו אות הלחץ היא יציבה. בחר לפחות 10 מחזורים רצופים של לב הנתונים שנרשמו בעניין.
    2. השתמש בתוכנת LabChart גרסה 8.0 או דומה כדי לנתח את קצב לב, את הלחץ הסיסטולי עזב המקסימאלי, ventr השמאל הדיאסטולי המינימלילחץ icular, שיעור השיא של התכווצות חדר השמאלי isovolumetric _{(מקסימום} / dt DP), שיעור השיא של רגיעה isovolumetric חדר השמאלי (DP / _min DT), הלחץ של החדר השמאלי הסוף-דיאסטולי, ומתמיד של חדר שמאל isovolumetric הזמן לחץ סתיו (טאו) ^7.
       הערה: לחץ הסוף-דיאסטולי תואם את הלחץ בנקודת הזמן מייד לפני זינוק הלחץ נגרם על ידי התכווצות isovolumetric. החישוב של טאו מבוסס על התאמת הלחץ בחדר שמאל לעקומת דעיכת monoexponential, הביע כP _(t) = + ^{-t / טאו} ב ₀ e P, בנוסחה זו, P _(t) הוא הלחץ של החדר השמאלי בזמן הושג t לאחר הערך השלילי המקסימאלי של DP / dt. ב הפרמטר מתאים לאסימפטוטה התיאורטית, אשר בגישה פשוטה ניתן להניח להיות אפס. ההרפיה isovolumetric משופרת תוצאות בערך קטן יותר של טאו.

תוצאות

של אוטם שריר לב במידה ניתן להעריך על ידי כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium אוונס הכחול / צביעה כפולה (TTC). TTC הוא אינדיקטור חיזור, אשר מומר ל1,3,5-triphenylformazan העמוק-האדום בחיים רקמות עקב הפעילות של dehydrogenases השונים בנוכחות NADH ^8. איור 1 מראה חתך מייצג של הלב ב 24 שעות לאחר קשירה ...

Discussion

שינויים כרוניים במבנה ותפקוד שריר לב, הפיתוח של הפרעה בתפקוד חדר שמאל, והתקדמות לאי ספיקת לב יכולים להיחקר במספר דגמים עכבריים ^12. שיפוץ ותפקוד לקוי של לב יכולים להיגרם על ידי פגיעה בשריר הלב או על ידי לחץ לעומס יתר המשני לרוחביים התכווצות אב העורקים, או עשויים ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Buprenorphine (Buprenex®)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal®)	Ceva
Betadine®	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Equipment
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3mm x 3mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.