谷氨酸和缺氧作为离体脊椎动物视网膜应力模型

摘要

有了这个研究中，我们实行规范的应力模型的隔离灌流牛视网膜对未来临床治疗试验。要么缺氧（纯的N _2）或谷氨酸应力（250μM谷氨酸）对由a-和b-波振幅为代表视网膜功能的效果进行了评价。

摘要

神经保护已调查的一个强电场在眼科研究在过去的几十年，并影响疾病如青光眼，视网膜血管阻塞症，视网膜脱落，以及糖尿病视网膜病变。它是本研究引入一个标准化应力模型为未来的临床前治疗试验的对象。

制备牛视网膜和灌注的饱和氧标准溶液中，ERG记录。记录稳定的B-波，缺氧（纯的N _2）或谷氨酸应力（250微米谷氨酸）后施加45分钟。调查于光感受器功能单独的影响，1毫天冬氨酸加到得到波。 ERG恢复75分钟进行监测。

对于缺氧，在为87.0％，波幅下降注意到（P <0.01），后45分钟（减少36.5％的冲刷P = 0.03结束后）博览会时间。此外，初始DECR缓解的记录87.23％b波振幅，即达到统计学意义（p <0.01，减少了25.5％，在冲洗结束时，p值= 0.03）。

为250微米的谷氨酸，初始还原，随后还原了1.9％（P> 0.05）a-波振幅（P> 0.05）7.8％。减少b波振幅（P <0.01），指出了83.7％;减少了75分钟的冲洗后为2.3％（P = 0.62）。在这项研究中，一个标准化的应力模型被呈现，可能是有用的，以确定在未来可能的神经保护作用。

引言

神经保护一直在调查研究的眼科在过去几十年的强场。视网膜是氧合显著取决于并强烈地受到其周围细胞的代谢的影响高度敏感的神经元网络。涉及神经细胞的损伤大眼病症是视网膜血管闭塞，青光眼和视网膜脱离。

视网膜动脉闭塞，作为网膜血管闭塞症，例如，导致视力突然损失，由于视网膜内层¹缺氧。它通常与一般的血管病理学²和导线的持久视觉损失^相关联，只有8％的患者恢复视力显著^1。虽然动脉纤溶 ​​已建议作为一种治疗选择，好处不能显示在一个随机临床试验^3。

青光眼和视网膜脱离都有增加谷氨酸浓度^4-6。生理条件下，谷氨酸遇到作为兴奋性发射机在整个中枢神经系统和视网膜内层^7,8。提高谷氨酸含量已经发现不仅在青光眼和视网膜脱离^5,6而且在增殖性糖尿病视网膜病变^9。谷氨酸的增加可能会导致兴奋性毒性，因此，神经细胞的损伤^10。在视网膜脱离和在某些情况下在视网膜上（玻璃体）增生性糖尿病性视网膜病的手术大多数情况下是必要的。在玻璃体机械操纵，明亮的光线光纤或在长期的经营中灌溉解决方案的高流速产生的剪切应力对视网膜^11,12施加了额外的压力。

所有的提到的疾病的共同之处在于所述病理定位于雷廷一个单独构成的眼科界的挑战，想方设法保护视网膜神经上一个系统。

电图（ERG）是用于在体内光感受器功能（一个波）和内视网膜（b波）的功能的评价的标准方法。 ERG的被引入到角膜银电极来测量和眼睛正在刺激光的增加的水平，以检测在杆或视锥细胞或视网膜内层缺陷。在视网膜的不同的缺陷可以通过改变幅度（响应的强度）或ERG的延迟（时间到响应的时间间隔）来检测。不同的ERG协议和测量方法（模式-ERG，多焦-ERG或明场ERG）允许缺陷进一步分化。分离的视网膜的技术最近已经引入，使得可以评估，而不脱离如一个研究动物的干扰在视网膜上的影响一般反应^13,14。

正是这种研究，评估和引进定义和标准化应力模型的缺氧和谷氨酸应力的隔离灌流视网膜的目的。因此，我们希望能为今后的某些代理商或眼内冲洗液的保护作用的研究奠定了基础。

研究方案

1.准备牛眼睛

1. 获得牛眼中的动物屠宰后直接。
2. 输送保护眼睛"Sickel溶液"含有120mM氯化钠，2mM的氯化钾，0.1mM的MgCl ₂的，0.15毫_氯化钙 ，1.5mM的的NaH ₂ PO _4，13.5毫的Na ₂ HPO ₄和5mM葡萄糖在一个特殊的介质RT。
3. 用昏暗红光暗适应的条件下进行视网膜的制备。
4. 取出眼睛的前部。执行赤道切口长约4毫米后的角膜缘。此后在一块除去角膜，虹膜，睫状体和透镜。请Sickel-解决方案的视网膜。
5. 机械地松开玻璃体附着物视网膜表面，并从打开的眼杯除去玻璃体。
6. 随后划分眼睛成四个象限和切出圆约领域直径7mm使用环钻。
7. 轻轻分开视网膜从色素上皮，并将其放置在记录设备上的内避光的盒子。该记录装置由一个塑料维护者在中间的网格的;放置在网格的视网膜，然后用一个塑料环，直接在电极上固定。
   注:塑料维护者有两个通道，以允许介质的恒定流速。

2.录音电图（ERG）

1. 为了记录的电图，使用两个银/氯化银电极在视网膜上的任一侧和灌注的视网膜在大约恒定的灌注速度1毫升/分钟和37℃的恒温。使用与氧饱和"Sickel-的解决方案"。
2. 开始测量之前，暗适应视网膜（在所有测量保护其不受光），并使用了5分钟的刺激间隔。使用1赫兹单一白色氙气闪光灯的刺激强度设定为6.3 MLX在视网膜表面。
3. 使用校准的中性密度滤光片和10微秒的光刺激由计时器为了具有最佳的反应进行控制。
4. 测量和处理数据，过滤的ERG，并用草RPS312RM放大器放大它（100赫兹的高通滤波器，50赫兹的陷波滤波器，100,000×放大）。试图筛选出可能的干扰频率，可能会干扰信号。为了处理数据，使用模拟 - 数字数据采集板的台式计算机（PC兼容）上。
5. 在恒定灌注的暗适应期后，测量的电信号的幅度，直到稳定b波振幅被记录。
   注:振幅被认为是稳定的，如果五个单测量达到一个平均值和偏差小于10％。单次测量的一个很好的例子是在图1。
6. 开始测试，无论是纯氮气代替纯氧（单实验数n = 5）来测试缺氧或250微米谷氨酸（N = 5）。
7. 记录电反应，每5分钟45分钟。
8. 在测试期结束后，灌注的视网膜与氧饱和75分钟的标准培养基，并期待在b-波振幅的变化。这是洗出阶段。测量从一个波到b-波的峰值的波谷的b-波幅度。
9. 调查低氧或谷氨酸上暗的条件下的感光体电位的效果，抑制b-波通过加入1mM至所述营养液。
10. 记录一个稳定的光感受器电位30分钟后，执行程序和以前一样，露出了视网膜45分钟，以不同的冲洗液以1 mM的天门冬氨酸。使用相同的洗脱期（步骤2.8）正如前面提到的。

3.数据分析

1. 为了统计评估数据，确保正常的分布所有的数据， 如使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫测试^15。
2. 计算的a-和b-波振幅的百分比在曝光阶段之后的减少相比，最后一次测量的论述之前。 45分钟后，比较ERG-振幅的减小 - 在暴露时段的结束 - 到ERG应用之前测量。
3. 比较在冲洗阶段相应幅度的论述之前结束的A股和B超波，研究可能的复苏。
4. 进行统计分析，使用该软件JMP统计软件SPSS或软件。整个计算的平均值±标准差的数据。估计由相应的统计检验的意义。
   注:这些测试可能会根据不同的实验范围。在这种背景下，使用学生的配对t检验。

结果

1小时视网膜制剂与氧饱和标准溶液（ 图1A和B）的灌注后ERG-振幅表现出稳定和单次测量之间的振幅的变化较小。 pH值，渗透压，温度和PO _2（除了低氧测试）保持恒定为所有测试。

为了隔离从内视网膜的信号的感光信号，1mM的天冬氨酸加入到标准溶液来抑制b-波（ 图1A）。在缺氧的效果测试，为87.0％，波幅下降注意到（P <0.01），后45分钟的曝光时间?...

讨论

在这项研究中，在缺氧的45分钟后的b波振幅的显著影响被发现。本次减持仍是冲洗阶段后显著。可以观察到在感光体电位类似的效果。

结果被其他公布的数据^16，给我们研究缺氧后可能神经保护作用的机会的支持。

后45分钟的论述250μM谷氨酸，我们没有发现只在b-波振幅为完全可逆的清除期的结束在统计学显著影响。感光体电位不是由250μM谷氨酸?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000