単離された灌流脊椎動物の網膜のためのストレスモデルとしてグルタミン酸および低酸素症

要約

本研究では、我々は将来の前臨床治療試験のための孤立した灌流ウシ網膜のための標準化された応力モデルをご紹介。 A及びB波振幅によって表さ網膜機能上のいずれかの低酸素（純粋なN _2）またはグルタミン酸ストレス（250μMグルタミン酸）の効果を評価した。

要約

神経保護は、過去数十年で眼科研究の調査の強い分野きや、緑内障、網膜血管閉塞、網膜剥離、および糖尿病性網膜症などの疾患に影響を与えています。それは、将来の前臨床治療試験のための標準化された応力モデルを紹介する本研究の目的であった。

ウシ網膜を調製し、灌流酸素飽和標準溶液とし、ERGを記録した。安定したB波を記録した後、低酸素（純粋N _2）またはグルタミン酸応力（250μmのグルタミン酸）が45分間に発揮した。単独の光受容体機能に対する効果を調べるために、1mMのアスパラギン酸は、波を得た。 ERG-回復は75分間モニターした。

低酸素症の場合、87.0％の波振幅の減少は45分（ウォッシュアウトP = 0.03の終了後に36.5％の減少）の露出時間の後に（P <0.01）が認められた。さらに、初期のDECR87.23パーセントのb波振幅の容易さは、統計的有意に（p <0.01、ウォッシュアウトの終了時の25.5％の減少はp = 0.03）に達したことを記録した。

250μmのグルタミン酸、1.9％た（p> 0.05）の減少が続く波振幅た（p> 0.05）の最初の7.8％の減少である。 b波振幅た（p <0.01）の83.7％の減少が認められた。 75分のウォッシュアウト後に減少が2.3％（P = 0.62）であった。本研究では、標準化されたストレスモデルは、将来の可能性神経保護効果を同定するために有用であり得ることが示されている。

概要

神経保護は、過去数十年で眼科研究の調査の強い分野となっている。網膜は、酸素化に大きく依存し、その周囲の細胞の代謝によって強く影響され、高感度の神経回路網である。神経細胞の損傷に関連する主な眼の病状は、網膜血管閉塞、緑内障、および網膜剥離である。

網膜動脈閉塞は網膜血管閉塞のための例として、内側網膜¹の低酸素状態に視力の突然の損失につながる。それは、多くの場合、一般的な血管の病理²に関連付けられており、患者のわずか8％を大幅に¹視力を回復し、永続的な視覚喪失¹につながる。動脈の線維素溶解が治療選択肢として提案されているが、利益は、無作為化臨床試験³に示すことができなかった。

緑内障と網膜剥離両方のグルタミン酸濃度^4-6の増加を持っている。生理学的条件下でグルタミン酸は、全体の中枢神経系全体に興奮トランスミッタと内側の網膜^7,8として検出された。上昇グルタミン酸レベルは、緑内障及び網膜剥離^5,6においても、増殖性糖尿病性網膜⁹のみならず発見されている。グルタミン酸の増加は、おそらく、したがって、神経細胞の損傷^10の興奮毒性につながり。網膜剥離の網膜（毛様体輪の硝子体切除）上の増殖性糖尿病網膜症の手術のいくつかのケースでは、ほとんどの場合必要です。扁平部の硝子体切除機械的操作時には、光ファイバーや長い操作中に灌漑ソリューションの高流量によって発揮されるせん断応力の明るい光が網膜^11,12に追加のストレスを発揮する。

すべての疾患は、病理がレチンに局在している点で共通している単独および感覚神経系として網膜を保護する方法を見つけるという課題に眼科コミュニティをもたらす。

電図（ERG）は、インビボで光受容体機能（波）と内網膜（b波）の機能を評価するための標準的な方法である。 ERGは、角膜内に導入銀電極で測定され、眼は、ロッドまたは円錐または内側の網膜の欠陥を検出するための光のレベルの増加によって刺激されている。網膜における異なる欠陥は、振幅（応答の強さ）またはERGの待ち時間（時間 - 応答間隔）の変化によって検出することができる。異なるERGプロトコルと測定方法（パターン-ERG、多焦点-ERGまたは明視野ERG）は、欠陥のさらなる差別化を可能にする。単離された網膜の技術により、試験動物の例からの干渉なしで、網膜への影響を評価すること、最近導入された一般的な反応は^13,14。

評価および灌流孤立網膜上の低酸素症およびグルタミン酸ストレスのために定義され、標準化された応力モデルを紹介するこの研究の目的だった。したがって、私たちは、特定の薬剤または眼内灌漑ソリューションの神経保護効果に関する今後の研究のための基礎を築くことを望んでいます。

プロトコル

ウシ目の調製

1. 動物が屠殺された直後に牛の目を入手します。
2. 120のNaCl、2のKCl、0.1のMgCl _2、0.15のCaCl _2、1.5 mMののNaH ₂ PO _4、13.5のNa ₂ HPO ₄および5 mMグルコースでを含む特別な媒体」Sickel-ソリューション」で保護された目を輸送RT。
3. 暗赤色灯と暗順応条件下での網膜の準備を行います。
4. 眼の前の部分を削除します。赤道切開CAを実行します角膜輪部に4ミリメートルの後部。その後、1枚で角膜、虹彩、毛様体およびレンズを取り外します。 Sickel-溶液中の網膜にしてください。
5. 機械的に網膜表面にガラス質の添付ファイルを緩め、オープンアイカップから硝子体を除去する。
6. その後4つの象限に目を分割し、約ラウンド領域をパンチアウトトレフィンを使用して直径7mm。
7. 静かに網膜を分離色素上皮から、光から保護ボックス内部の記録装置の上に置きます。記録装置は、中央にメッシュプラスチックメンテナで構成されています。メッシュ上に、網膜を配置し、電極上に直接プラスチックリングで固定します。
   NOTE：プラスチックメンテ媒体の一定の流れを可能にするために二つのチャンネルを有している。

2.録音電図（ERG）

1. 、電位図を記録する網膜の両側にある銀/塩化銀電極を使用し、約一定の灌流速度で網膜を灌流するために1ml /分、37℃の一定温度。酸素で飽和した「Sickel-ソリューション」を使用してください。
2. 測定を開始する前に、暗い網膜を適応させる（すべての測定中に光から保護する）と、5分の刺激間隔を使用しています。網膜表面で6.3 MLXに設定された強度で刺激のための1 Hzの単一の白色キセノンフラッシュを使用してください。
3. 使用は、最適な応答を得るために、減光フィルタ、タイマによって制御さ10マイクロ秒の光刺激をキャリブレート。
4. グラスRPS312RMアンプを使用して（100Hzのハイパスフィルタ、50 Hzのノッチフィルタ100,000のx増幅）を測定し、処理したデータを、ERGをフィルタリングして増幅した。信号を乱す可能性のある妨害の周波数をフィルタリングしてみてください。データを処理するために、デスクトップコンピュータ（PC互換性のある）のアナログ·デジタルデータ収集ボードを使用する。
5. 安定b波振幅が記録されるまで一定の灌流下暗順応期間の後、電気信号​​の振幅を測定する。
   注：5つの測定値が平均値に達し、10％未満を逸脱した場合には、振幅が安定しているとみなされる。単一の測定値の良い例は、 図1に示されている。
6. テストを開始するには、純粋な窒素で純酸素を交換する（単一の実験の数、n = 5）の低酸素状態をテストするまたは250μmのグルタミン酸（n = 5）であった。
7. 電気的応答45分間5分毎に記録します。
8. テスト期間の後、75分間酸素で飽和した標準培地で網膜を灌流し、b波振幅の変化を見てください。これはウォッシュアウトフェーズです。 b波のピークまでのA波の谷からb波の振幅を測定します。
9. 暗順応条件下で、感光体電位に対する低酸素またはグルタミン酸の効果を調べるために、栄養液に1mMのを追加することによってb波を抑制する。
10. 30分間の安定した感光体の電位を記録した後、1mMのアスパラギン異なる洗浄溶液に網膜45分​​間さらす前と同様の手順を行う。前述のように同じ休薬期間（ステップ2.8）を使用します。

3.データ分析

1. 統計的データを評価するために、 例えば、コルモゴロフ-スミルノフを使用して、すべてのデータのための正規分布を確実にするテスト^15。
2. 博覧会の前に最後の測定と比較して露光段階後の割合でA及びB波の振幅の減少を計算します。 45分後にERG-振幅の減少を比較する - 展示期間の終わり - ERGへの適用前に測定した。
3. 可能な回復を調べるために博覧会前に、対応する振幅にウォッシュアウトフェーズの終了時にA-とB-波の比較。
4. 統計分析のために、ソフトウェアJMP統計ソフトウェアまたはSPSSソフトウェアを使用しています。平均±標準偏差として全体のデータを計算します。適切な統計的検定によって有意性を推定します。
   注：これらのテストは、実験的な範囲に応じて異なる場合があります。この設定では、スチューデントのt検定を使用しています。

結果

酸素飽和標準溶液（ 図1AおよびB）と網膜製剤の灌流の1時間後にERG-振幅が安定化し、単一の測定値との間の振幅のより少ない変動を示した。 pHは、浸透圧、温度、及び（低酸素症試験を除く）のpO _2は、すべてのテストのために一定に維持した。

内網膜の信号から光受容体の信号を分離するために、1mMのアスパラギン酸は、b波（ 図1A）を抑制する?...

ディスカッション

本研究では、低酸素症の45分後にb波の振幅に有意な影響が見られた。この減少は、依然としてウォッシュアウト段階の後に有意であった。感光性に関する同様の効果が観察された。

結果は、他の公開されたデータ¹⁶でサポートされているし、私たちに低酸素症の後の可能な神経保護効果を研究する機会を与えている。

250μMのグルタミン酸の4...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000