El glutamato y la hipoxia como un Modelo de estrés para el perfundido aislado Vertebrados Retina

Resumen

Con este estudio, presentamos un modelo de estrés estandarizado para la retina bovina superfundido aislada para futuras pruebas terapéutica preclínica. Se evaluó el efecto de cualquiera de hipoxia (N ₂ puro) o estrés glutamato (250 glutamato mM) sobre la función retiniana representado por a- y amplitudes de la onda b.

Resumen

Neuroprotección ha sido un fuerte campo de la investigación en la investigación oftalmológica en las últimas décadas y afecta a enfermedades como el glaucoma, la oclusión vascular retiniana, desprendimiento de retina y la retinopatía diabética. Era el objeto de este estudio para introducir un modelo de estrés estandarizado para futuras pruebas terapéutica preclínica.

Retinas bovinas se prepararon y perfundidos con una solución estándar saturada de oxígeno, y el ERG se registró. Después de registrar ondas b estables, hipoxia (n pura ₂₎ o el estrés glutamato (250 micras glutamato) se ejerció durante 45 min. Para investigar los efectos sobre la función de los fotorreceptores solo, se añadió aspartato 1 mM para obtener una de las ondas. ERG-recuperación se controló durante 75 min.

Para la hipoxia, una disminución en una onda de amplitud de 87,0% se observó (p <0,01) después de un tiempo de exposición de 45 min (disminución de 36,5% después del final de la lavado p = 0,03). Además, un decr inicialfacilidad de amplitudes b-onda de 87,23% se registró, que alcanzó significación estadística (p <0,01, disminución de 25,5% al ​​final del lavado, p = 0,03).

Por 250 micras glutamato, una reducción inicial del 7,8% de las amplitudes de una onda (p> 0,05), seguido de una reducción del 1,9% (p> 0,05). Una reducción del 83,7% de las amplitudes de la onda b (p <0,01) fue observado; después de un lavado de 75 min, la reducción fue del 2,3% (p = 0,62). En este estudio, un modelo de estrés se presenta estandarizada que puede ser útil para identificar posibles efectos neuroprotectores en el futuro.

Introducción

Neuroprotección ha sido un fuerte campo de la investigación en la investigación oftalmológica en las últimas décadas. La retina es una red neuronal altamente sensible que depende significativamente de la oxigenación y está influenciada fuertemente por el metabolismo de sus células circundantes. Las principales patologías oculares relacionados con el daño de las células nerviosas son oclusiones vasculares de la retina, glaucoma y desprendimiento de retina.

Oclusión de la arteria de la retina, como un ejemplo para la oclusión vascular retiniana, conduce a una pérdida repentina de la visión debido a la hipoxia de la retina interna ^1. A menudo se asocia con patologías vasculares generales ² y conduce a una pérdida de la visión persistente ^1, con sólo el 8% de los pacientes que se recuperan de la agudeza visual significativamente ^1. Aunque la fibrinólisis arterial se ha sugerido como una opción de tratamiento, el beneficio no se pudo demostrar en un ensayo clínico aleatorizado ^3.

El glaucoma y desprendimiento de retinaambos tienen un aumento en la concentración de glutamato ^4-6. El glutamato en condiciones fisiológicas se encuentra como un transmisor excitador en todo el sistema nervioso central y el ^7,8 retina interna. Niveles de glutamato elevados se han encontrado no sólo en el glaucoma y desprendimiento de retina ^5,6, sino también en la retinopatía diabética proliferativa ^9. Un aumento en el glutamato posiblemente conduce a la excitotoxicidad y, por lo tanto, el daño de la célula nerviosa ^10. En la mayoría de los casos de desprendimiento de retina y, en algunos casos de retinopatía diabética proliferativa de la cirugía sobre la retina (vitrectomía pars plana) son necesarios. Durante la vitrectomía pars plana manipulación mecánica, la luz brillante de la fibra óptica o el estrés de cizalla ejercida por las altas tasas de flujo de las soluciones de riego durante las operaciones largas ejercen una presión adicional sobre la retina ^11,12.

Todas las enfermedades mencionadas tienen en común que la patología se localiza en el retinuna sola y plantean la comunidad oftalmológica con el desafío de encontrar formas de proteger la retina como un sistema neurosensorial.

El electrorretinograma (ERG) es el método estándar para la evaluación de la función in vivo de los fotorreceptores (una onda) y la función de la retina interna (la onda b). El ERG se mide por plata-electrodos introducidos en la córnea y los ojos están siendo estimulado por un creciente nivel de luz para detectar defectos en varillas o conos o en la retina interna. Diferentes defectos de la retina pueden ser detectados por cambios en la amplitud (la fuerza de la respuesta) o la latencia (la respuesta de intervalo de tiempo-a-) de la ERG. Diferentes métodos de protocolo y medición ERG (patrón-ERG, multifocal-ERG o brillante campo ERG) permiten una mayor diferenciación de los defectos. La técnica de la retina aislada se ha introducido recientemente, por lo que es posible evaluar los efectos sobre la retina sin interferencias de por ejemplo un animal de estudioreacciones generales ^13,14.

Era el propósito de este estudio para evaluar e introducir un modelo de estrés definido y estandarizado para la hipoxia y el estrés de glutamato en la retina aislada superfused. Por lo tanto, tenemos la esperanza de sentar las bases para futuros estudios sobre los efectos neuroprotectores de determinados agentes o soluciones de irrigación intraoculares.

Protocolo

1. Preparación de la especie bovina Ojos

1. Obtener ojos bovinos directamente siguientes al sacrificio del animal.
2. Transportar los ojos protegidos en "Sickel-solución" un medio especial que contiene NaCl 120 mM, 2 mM KCl, 0,1 mM de MgCl _2, 0,15 mM CaCl _2, 1,5 mM NaH ₂ PO ₄ mM de glucosa, 13,5 mM Na ₂ HPO ₄ y 5 en RT.
3. Realizar la preparación de la retina en condiciones adaptados a la oscuridad con una luz roja tenue.
4. Retire la parte anterior del ojo. Realizar una incisión ecuatorial ca. 4 mm por detrás del limbo. A partir de entonces eliminar córnea, el iris, el cuerpo ciliar y la lente en una sola pieza. Mantenga las retinas en Sickel-solución.
5. Mecánicamente aflojar los archivos adjuntos vítreo a la superficie de la retina y quitar el vítreo de la copa ojo abierto.
6. Luego divida el ojo en cuatro cuadrantes y rompa ronda áreas de ca. 7 mm de diámetro utilizando un trépano.
7. Separar suavemente la retinadel epitelio pigmentario y colocarlo en un dispositivo de grabación dentro de una caja protegida de la luz. El dispositivo de grabación consta de un mantenedor de plástico con una malla en el centro; colocar la retina en la malla y luego fijar con un anillo de plástico directamente sobre los electrodos.
   NOTA: El mantenedor de plástico tiene dos canales para permitir un flujo constante del medio.

2. Grabación de la Electrorretinograma (ERG)

1. Con el fin de registrar el electrorretinograma, utilizar dos electrodos de plata / cloruro de plata-a cada lado de la retina y perfundir la retina a una velocidad de perfusión constante de ca. 1 ml / min y temperatura constante de 37 ° C. Utilice la opción "Sickel-solución" saturada de oxígeno.
2. Antes de iniciar la medición, oscuro adaptar la retina (protegerlo de la luz durante todas las mediciones) y utilizar intervalos de estímulo de cinco minutos. Use un 1 Hz solo flash de xenón blanco para la estimulación con una intensidad ajustado a 6,3 mlx en la superficie de la retina.
3. Uso calibrado filtros de densidad neutra y un estímulo de luz de 10 microsegundos controlado por un temporizador con el fin de tener respuestas óptimas.
4. Para medir y procesar los datos, filtrado del ERG y amplificarlo (filtro de paso alto de 100 Hz, 50 Hz filtro de muesca, 100000 x amplificación) utilizando un RPS312RM Amplificador Hierba. Trate de filtrar las posibles frecuencias perturbadoras que puedan perturbar la señal. Para procesar los datos, utilice una tarjeta de adquisición analógico-digital de datos en un ordenador de sobremesa (PC compatible).
5. Después del periodo de adaptación a la oscuridad bajo perfusión constante, medir las amplitudes de la señal eléctrica hasta que se registran las amplitudes de la onda b estables.
   NOTA: Amplitudes se consideran estables si cinco mediciones individuales alcanzan un valor medio y se desvían menos de 10%. Un buen ejemplo de mediciones individuales se da en la Figura 1.
6. Para iniciar la prueba, reemplazar oxígeno puro ya sea por nitrógeno puro (número de experimentos individuales, n = 5) para la prueba de hipoxiao glutamato 250 m (n = 5).
7. Anote las respuestas eléctricas cada 5 min durante 45 min.
8. Después del período de prueba, perfundir las retinas con medio estándar saturada de oxígeno durante 75 minutos y ver los cambios de la amplitud de la onda b. Esta es la fase de lavado. Mida la amplitud de la onda b del punto más bajo de la onda a que el pico de la onda b.
9. Para investigar el efecto de la hipoxia o glutamato en el potencial de los fotorreceptores en condiciones escotópicas, suprimir la onda b mediante la adición de 1 mM a la solución de nutrientes.
10. Después de grabar un potencial fotorreceptor estable durante 30 minutos, llevar a cabo el procedimiento que antes, exponiendo las retinas de 45 minutos a las diferentes soluciones de riego con 1 mM aspartato. Utilice el mismo período de lavado (paso 2.8) como se mencionó anteriormente.

Análisis 3. Datos

1. A fin de evaluar estadísticamente los datos, garantizar una distribución normal para todos los datos, por ejemplo, utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnovprueba ^15.
2. Calcular la reducción de las amplitudes A y B en porcentajes de onda después de la fase de exposición en comparación con la última medición antes de la exposición. Comparación de la reducción de los ERG-amplitudes después de 45 min - al final del período de exposición - a ERG medido antes de la aplicación.
3. Comparar la onda a- y b- al final de la fase de lavado a la amplitud correspondiente antes de la exposición para examinar una posible recuperación.
4. Para el análisis estadístico, utilice el software software estadístico JMP o software SPSS. Calcular datos en todo momento como la media ± desviación estándar. Estimar importancia por la prueba estadística apropiada.
   NOTA: Estas pruebas pueden ser diferentes según el ámbito experimental. En esta configuración, utilice la prueba t pareada de Student.

Resultados

Después de 1 hora de la perfusión de los preparativos de la retina con solución estándar saturada de oxígeno (Figura 1A y B) ERG-amplitudes mostraron estabilización y una menor variación de amplitudes entre las mediciones individuales. pH, la presión osmótica, la temperatura, y pO ₂ (excepto para las pruebas de hipoxia) se mantuvieron constantes para todas las pruebas.

Para aislar la señal de los fotorreceptores de la señal de la retina interna, 1 mM aspar...

Discusión

En este estudio, se encontró un impacto significativo en la amplitud de la onda b después de 45 min de la hipoxia. Esta reducción fue todavía significativa después de la fase de lavado. Un efecto similar sobre el potencial de los fotorreceptores se pudo observar.

Los resultados son apoyados por otros datos publicados ¹⁶ y darnos la oportunidad de estudiar los posibles efectos neuroprotectores después de la hipoxia.

Después de 45 min de exposici?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000