Glutamat und Hypoxie als Stress-Modell für die isolierten perfundierten Wirbel Retina

Zusammenfassung

Mit dieser Studie stellen wir einen standardisierten Stress-Modell für die isolierte superfundiert Rinderretina für zukünftige therapeutische präklinischen Tests. Die Wirkung von entweder Hypoxie (reines N ₂₎ oder Glutamat Stress (250 uM Glutamat) auf Netzhautfunktion von a- und b-Wellenamplituden dargestellt wurde ausgewertet.

Zusammenfassung

Neuroprotektion ist in der ophthalmologischen Forschung in den letzten Jahrzehnten eine starke Untersuchungsfeld und wirkt sich Krankheiten wie Glaukom, Netzhautgefäßverschluss, Netzhautablösung, und diabetische Retinopathie. Es war das Ziel dieser Studie, einen standardisierten Stress-Modell für zukünftige therapeutische präklinischen Tests einzuführen.

Rindernetzhäute wurden präpariert und mit einem Sauerstoff gesättigt Standardlösung durchströmt, und der ERG wurde aufgezeichnet. Nach dem Aufzeichnen stabil b-Wellen, Hypoxie (reines N ₂₎ oder Glutamat Belastung (250 & mgr; m glutamat) wurde für 45 min ausgeübt wird. Um die Auswirkungen auf allein Photorezeptorfunktion zu untersuchen, wurde 1 mM zugegeben, um eine Aspartat-Wellen erhalten. ERG-Erholung wurde für 75 min überwacht.

Hypoxie wurde eine Abnahme in einer Wellenamplitude von 87,0% nach einer Expositionszeit von 45 min (Abnahme von 36,5% nach dem Ende der Auswaschphase p = 0,03) angemerkt (p <0,01). Zusätzlich wird ein Anfangs decrLeichtigkeit der b-Wellenamplituden von 87,23% erfasst wurde, dass die statistische Signifikanz erreichte (p <0,01, Abnahme von 25,5% am Ende der Auswaschphase, p = 0,03).

Für 250 & mgr; m Glutamat, einem anfänglichen 7,8% Reduktion der a-Wellen-Amplituden (p> 0,05), gefolgt von einer Reduktion von 1,9% (p> 0,05). Eine Verringerung von 83,7% der b-Wellenamplituden (p <0,01) wurde festgestellt; nach einer Auswaschung von 75 min war die Reduktion von 2,3% (p = 0,62). In dieser Studie wird eine standardisierte Spannungsmodell dargestellt, die nützlich für mögliche neuroprotektive Wirkung in der Zukunft identifiziert werden kann.

Einleitung

Neuroprotektion ist ein starker Forschungsgebiet in der ophthalmologischen Forschung in den letzten Jahrzehnten. Die Retina ist ein hochempfindliches neuronalen Netzwerk, hängt signifikant von Sauerstoffversorgung und wird stark durch den Stoffwechsel des ihn umgebenden Zellen beeinflusst. Die wichtigsten Augenkrankheiten zu Schädigungen von Nervenzellen im Zusammenhang stehen retinalen Gefäßverschlüssen, Glaukom und Netzhautablösung.

Arterienverschluss, als Beispiel für die Netzhautgefäßverschluss führt zu einem plötzlichen Verlust des Sehvermögens durch Hypoxie des inneren Netzhaut ^ein. Es wird häufig mit allgemein vaskulären Pathologien ² und führt zu einer anhaltenden Sehverlust ¹ zugeordnet sind, wobei nur 8% der Patienten nach der Sehschärfe signifikant ^1. Obwohl arteriellen Fibrinolyse wurde als Behandlungsoption vorgeschlagen worden, könnte der Nutzen nicht in einer randomisierten klinischen Studie ³ angezeigt.

Glaukom und Netzhautablösungbeide haben eine Erhöhung der Glutamatkonzentration ^4-6. Glutamat unter physiologischen Bedingungen als exzitatorische Transmitter im gesamten Zentralnervensystem und der inneren Retina ^7,8 angetroffen. Erhöhte Glutamatspiegel nicht nur bei Glaukom und Netzhautablösung ^5,6, sondern auch in proliferative diabetische Retinopathie ⁹ gefunden. Eine Erhöhung Glutamat führt möglicherweise zu Exzitotoxizität und daher Nervenzellschädigung ^10. In den meisten Fällen von Netzhautablösung und in einigen Fällen der proliferativen diabetischen Retinopathie Operation auf der Netzhaut (Vitrektomie) notwendig. Während der Vitrektomie mechanische Manipulation, helles Licht von der optischen Faser oder durch hohe Durchflussraten von Spüllösungen bei langen Operationen ausgeübten Scherspannung üben eine zusätzliche Belastung auf der Netzhaut ^11,12.

Alle genannten Erkrankungen ist gemeinsam, dass die Pathologie zur retin lokalisiertenein allein und stellen die ophthalmologische Gemeinschaft vor der Herausforderung, Wege, um die Netzhaut als neurosensorische System zu schützen.

Das Elektroretinogramm (ERG) ist das Standardverfahren für die Bewertung der in vivo-Photorezeptor-Funktion (a-Welle), und die Funktion der inneren Retina (b-Welle). Die ERG wird durch Silber-Elektroden in die Hornhaut eingeführt, gemessen und die Augen sind durch eine zunehmende Licht stimuliert, um Defekte in Stäbchen oder Zapfen oder in der inneren Netzhaut erkennen. Unterschiedliche Fehler in der Netzhaut kann durch Veränderungen in der Amplitude (der Stärke der Antwort) oder die Latenz (die Zeit bis zur Antwort-Intervall) des ERG festgestellt werden. Verschiedene ERG-Protokoll und Messverfahren (Muster-ERG, multifokalen ERG-oder Hellfeld-ERG) ermöglichen eine weitere Differenzierung von Mängeln. Die Technik des isolierten Netzhaut wurde vor kurzem eingeführt wurde, wodurch es möglich wird, um Effekte auf die Netzhaut ohne Interferenzen von zB eine Studie Tieres zu evaluierenAllgemeinreaktionen ^13,14.

Es war das Ziel dieser Studie zu bewerten, und die Einführung einer definierten und standardisierten Spannungsmodell für Hypoxie und Glutamat Belastung des Superfusion isoliert Retina. So hoffen wir, die Grundlagen für künftige Studien über neuroprotektive Effekte von bestimmten Agenten oder intraokularen Spüllösungen legen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Rinderaugen

1. Erhalten Rinderaugen direkt nach der Schlachtung des Tieres.
2. Transportieren die geschützten Augen "sichel Lösung" ein spezielles Medium, enthaltend 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,1 mM MgCl _2, 0,15 mM CaCl _2, 1,5 mM NaH ₂ PO _4, 13,5 mM Na ₂ HPO ₄ und 5 mM Glucose bei RT.
3. Führen Sie die Vorbereitung der Netzhaut unter dunklen Bedingungen angepasst mit einem dim rotes Licht.
4. Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges. Führen Sie einen äquatorialen Schnitt ca. 4 mm hinter dem Limbus. Hornhaut, Iris, Ziliarkörper und Linse Danach entfernen Sie in einem Stück. Halten Sie die Netzhaut in Sickel-Lösung.
5. Mechanisch lösen Sie die Glaskörper-Anhänge an den Netzhautoberfläche und entfernen Sie die Glaskörper aus der offenen Augenmuschel.
6. Danach teilen das Auge in vier Quadranten und Punch-Out runden Flächen von ca. 7 mm Durchmesser mit einem Hohlbohrer.
7. Trennen die Netzhaut vorsichtigaus dem Pigmentepithel und auf ein Aufnahmegerät in einem Karton vor Licht geschützt. Die Aufzeichnungsvorrichtung besteht aus einem Kunststoff mit einer Maschen Betreuers in der Mitte; legen Sie die Netzhaut auf dem Netz und dann fix mit einem Kunststoffring direkt auf den Elektroden.
   HINWEIS: Die Kunststoff Maintainer hat zwei Kanäle, um eine konstante Strömung des Mediums zu ermöglichen.

2. Aufnahme der Elektroretinogramm (ERG)

1. Um das Elektroretinogramm aufzunehmen, verwenden zwei Silber / Silberchlorid-Elektroden auf jeder Seite der Netzhaut und versorgen die Retina bei einer konstanten Geschwindigkeit von ca. Perfusion 1 ml / min, und konstanter Temperatur von 37 ° C. Verwenden Sie die "Sickel-Lösung" mit Sauerstoff gesättigt.
2. Vor Beginn der Messung, dunkel Anpassung der Netzhaut (Schutz vor Licht bei allen Messungen) und verwenden Sie Stimulus Abständen von fünf Minuten. Verwenden Sie eine 1 Hz einzelne weiße Xenon-Blitz für die Stimulation mit einer Intensität von 6,3 mlx an der Netzhautoberfläche gesetzt.
3. Verwenden kalibrierten Neutralfilter und einen Lichtreiz von 10 us durch einen Timer, um optimale Antworten haben gesteuert.
4. Zur Messung und Verarbeitung der Daten, filtern die ERG und verstärken sie (100 Hz Hochpassfilter, 50 Hz Notch-Filter, 100.000 x Verstärkung) mit einem Gras RPS312RM Verstärker. Versuchen herausfiltern möglich Störfrequenzen, die das Signal stören können. Um die Daten zu verarbeiten, verwenden Sie einen Analog-zu-Digital-Datenerfassungskarte auf einem Desktop-Computer (PC-kompatibel).
5. Nach der Dunkeladaptation Zeitraum konstant Perfusion messen die Amplituden des elektrischen Signals, bis stabile b-Wellenamplituden erfasst werden.
   HINWEIS: Die Amplituden gilt als stabil, wenn fünf Einzelmessungen erreicht einen Mittelwert abweichen und weniger als 10%. Ein gutes Beispiel für Einzelmessungen wird in Abbildung 1 wiedergegeben.
6. Um den Test zu starten, wechseln reinem Sauerstoff entweder durch reinen Stickstoff (Anzahl der Einzelversuche, n = 5), um eine Hypoxie testenoder 250 & mgr; m Glutamat (n = 5).
7. Notieren Sie die elektrischen Antworten alle 5 min für 45 min.
8. Nach der Testphase durchströmen die Netzhaut mit Standardmedium mit Sauerstoff gesättigt 75 Minuten und Blick auf die Veränderungen der b-Wellenamplitude. Dies ist der Auswaschphase. Messen des b-Wellenamplitude von der Wanne der a-Welle auf die Spitze der b-Welle.
9. Um die Wirkung von Hypoxie oder Glutamat an der Photorezeptor-Potentials unter skotopischen Bedingungen zu untersuchen, unterdrücken die b-Welle, die durch Zugabe von 1 mM in die Nährlösung.
10. Nach der Aufnahme einer stabilen Photorezeptor-Potentials für 30 Minuten, führt das Verfahren nach wie vor Freilegung der Netzhaut 45 Minuten zu den verschiedenen Spüllösungen mit 1 mM Aspartat. Verwenden Sie den gleichen Zeitraum Auswaschen (Schritt 2.8), wie oben erwähnt.

3. Datenanalyse

1. Um die Daten statistisch auszuwerten, sorgen für eine Normalverteilung für alle Daten, beispielsweise unter Verwendung des Kolmogorov-SmirnovTest ^15.
2. Berechnen Sie die Reduzierung der a- und b-Wellenamplituden in Prozent nach der Belichtungsphase im Vergleich zur letzten Messung vor der Ausstellung. Vergleichen Sie die Reduzierung der ERG-Amplituden nach 45 Minuten - am Ende der Ausstellung Zeitraum - zum ERG gemessen vor der Anwendung.
3. Vergleichen der A- und B-Welle am Ende der Auswaschphase zur entsprechenden Amplitude vor Exposition, um eine mögliche Wiederherstellung zu prüfen.
4. Für die statistische Analyse, die Software JMP Statistik-Software SPSS oder Software. Berechnen von Daten im gesamten als Mittelwert ± Standardabweichung. Schätzwert von der entsprechenden statistischen Grundlage.
   HINWEIS: Diese Tests können unterschiedlich sein, je nach Versuchsumfang. Bei dieser Einstellung verwendet der Student-gepaarten t-Test.

Ergebnisse

Nach 1 Stunde der Durchblutung der Netzhautpräparate mit sauerstoffgesättigten Standardlösung (1A und B) ERG-Amplituden zeigten Stabilisierung und weniger Variation der Amplituden zwischen Einzelmessungen. pH-Wert, osmotischer Druck, Temperatur und pO ₂ (außer für Hypoxie testing) wurden für alle Versuche konstant gehalten.

Um die Photorezeptorsignal aus dem Signal der inneren Retina zu isolieren, wurde 1 mM Aspartat zu der Standardlösung zugesetzt, um die b-W...

Diskussion

In dieser Studie wurde eine signifikante Auswirkung auf die b-Wellenamplitude nach 45 min von Hypoxie gefunden. Diese Reduktion war nach der Auswaschphase signifikant. Eine ähnliche Wirkung auf die Photorezeptor-Potentials beobachtet werden.

Die Ergebnisse werden von anderen veröffentlichten Daten ¹⁶ und geben Sie uns die Gelegenheit, mögliche neuroprotektive Effekte nach Hypoxie Studium unterstützt.

Nach 45 min Exposition von 250 & mgr; M Glut...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000