Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina

Resumo

Com este estudo, apresentamos um modelo de estresse padronizado para a retina bovina superfundido isolado para o futuro teste pré-clínico terapêutico. O efeito de qualquer hipóxia (puro N ₂₎ ou estresse glutamato (250 mM glutamato) em função da retina representado por a- e amplitudes da onda-b foi avaliado.

Resumo

Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas e afeta doenças como glaucoma, oclusão vascular da retina, descolamento de retina, e retinopatia diabética. Era o objeto deste estudo a introdução de um modelo de estresse padronizado para futuro teste pré-clínico terapêutico.

Retina bovina foram preparadas e perfundido com uma solução saturada de oxigénio padrão, e o ERG foi gravado. Depois de gravar b-ondas estáveis, hipoxia (N ₂₎ puro ou estresse glutamato (250 um glutamato) foi exercida por 45 min. Para investigar os efeitos sobre sozinho função de fotorreceptores, 1 mM aspartato foi adicionada para obter a-ondas. ERG-recuperação foi monitorada por 75 min.

Para hipoxia, uma diminuição na amplitude da onda-um de 87,0% foi observada (p <0,01) após um tempo de exposição de 45 min (36,5% de redução após o final da lavagem p = 0,03). Além disso, um decr inicialfacilidade de amplitudes de ondas de b-87.23% foi registada, que atingiu significado estatístico (p <0,01, diminuição de 25,5% no final da lavagem, p = 0,03).

Para 250 um glutamato, uma redução inicial de 7,8% de um amplitudes de ondas (p> 0,05), seguidas por uma redução de 1,9% (p> 0,05). Uma redução de 83,7% da amplitude da onda b (p <0,01) foi observado; após uma lavagem de 75 min, a redução foi de 2,3% (p = 0,62). Neste estudo, um modelo de tensão é apresentada normalizada que pode ser útil para identificar possíveis efeitos neuroprotectores no futuro.

Introdução

Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas. A retina é uma rede neuronal altamente sensível que depende significativamente a oxigenação e é fortemente influenciado pelo metabolismo das suas células vizinhas. As principais patologias oculares relacionadas com a lesão das células nervosas são oclusões vasculares retinianas, glaucoma e descolamento da retina.

A oclusão da artéria retinal, como um exemplo para a oclusão vascular da retina, leva a uma perda súbita de visão devido a hipoxia da retina interna ^1. Ela é freqüentemente associada com patologias vasculares gerais ² e leva a uma perda visual persistente ^1, com apenas 8% dos pacientes em recuperação da acuidade visual significativamente ^1. Apesar de a fibrinólise arterial tem sido sugerida como uma opção de tratamento, o benefício não poderia ser mostrado em um ensaio clínico randomizado ^3.

Glaucoma e descolamento de retinaambos têm um aumento na concentração de glutamato ^4-6. O glutamato sob condições fisiológicas é encontrado como um transmissor excitatório ao longo de todo o sistema nervoso central e retina interna a ^7,8. Elevados níveis de glutamato foram encontradas não só em glaucoma e descolamento de retina ^5,6, mas também na retinopatia diabética proliferativa ^9. Um aumento em glutamato conduz possivelmente a excitotoxicidade e, portanto, danos das células nervosas ^10. Na maioria dos casos de descolamento da retina e em alguns casos de cirurgia de retinopatia diabética proliferativa na retina (vitrectomia via pars plana) são necessários. Durante a manipulação mecânica vitrectomia, luz brilhante da fibra óptica ou tensão de cisalhamento exercida por altas taxas de fluxo de soluções de irrigação durante as operações longas exercer uma pressão adicional sobre a retina ^11,12.

Todas as doenças mencionadas têm em comum que a patologia está localizada ao retinuma só e representam a comunidade oftalmológica com o desafio de encontrar formas de proteger a retina como um sistema neurossensorial.

O electrorretinograma (ERG) é o método padrão para a avaliação in vivo da função de fotorreceptores (uma onda) e a função da retina interna (b-ondas). O ERG é medido por eléctrodos de prata-introduzidos na córnea e os olhos estão a ser estimulado por um aumento do nível de luz para detectar defeitos em bastonetes ou cones ou na retina interna. Diferentes defeitos na retina pode ser detectada por alterações na amplitude (a força da resposta) ou a latência (o intervalo de tempo de resposta-para) do ERG. Diferentes protocolos e métodos de medição ERG (padrão-ERG, multifocal ERG-campo ou brilhante ERG) permitem uma maior diferenciação de defeitos. A técnica da retina isolado foi introduzida recentemente, tornando-se possível avaliar os efeitos sobre a retina, sem interferências de um animal, por exemplo o estudo dereações gerais ^13,14.

Foi o propósito deste estudo para avaliar e introduzir um modelo de estresse definido e padronizado para hipóxia e estresse glutamato na retina superfused isolado. Assim, nós estamos esperando para lançar as bases para futuros estudos sobre efeitos neuroprotetores de determinados agentes ou soluções de irrigação intra-oculares.

Protocolo

1. Preparação de Bovinos Olhos

1. Obter bovina olhos imediatamente após o abate do animal.
2. Transportar os olhos protegidos em "Sickel-solução" uma forma especial, contendo NaCl 120 mM, KCl a 2 mM, 0,1 mM de _MgCl2, 0,15 mM de _CaCl2, 1,5 mM de NaH ₂ PO _4, 13,5 mM de Na ₂ HPO ₄ e 5 mM de glucose no RT.
3. Realizar a preparação da retina em condições adaptadas escuro com uma luz vermelha ofuscante.
4. Retire a parte anterior do olho. Executar uma ca. incisão equatorial 4 milímetros posterior ao limbo. Posteriormente remover córnea, íris, corpo ciliar e lente em uma única peça. Mantenha as retinas em Sickel-solução.
5. Mecanicamente soltar os anexos vítreas para a superfície da retina e do vítreo remover da taça olho aberto.
6. Depois divida o olho em quatro quadrantes e perfurar rodada áreas de ca. 7 milímetros de diâmetro usando uma trefina.
7. Suavemente separar da retinado epitélio pigmentar e colocá-lo em um dispositivo de gravação dentro de uma caixa protegida da luz. O dispositivo de gravação é composto por uma manutenção de plástico com uma malha no meio; colocar a retina na malha e, em seguida, fixar com um anel de plástico directamente sobre os eléctrodos.
   NOTA: O mantenedor de plástico tem dois canais para permitir um fluxo constante do meio.

2. A gravação do eletrorretinograma (ERG)

1. A fim de gravar o electrorretinograma, usar dois eléctrodos de prata / prata-cloreto de cada lado da retina e perfundir a retina a uma velocidade de perfusão constante de ca. 1 ml / min e temperatura constante de 37 ° C. Use a "Sickel-solução" saturada com oxigênio.
2. Antes de iniciar a medição, adaptar escuro da retina (proteger da luz durante todas as medições) e usar intervalos de estímulo de cinco min. Use um único flash xenon branco 1 Hz para a estimulação com uma intensidade definido para 6,3 mlx na superfície da retina.
3. Uso calibrado filtros de densidade neutra e um estímulo de luz de 10 ms controlado por um temporizador, de modo a apresentar respostas óptimas.
4. Para medir e processar os dados, filtrar o ERG e amplificá-lo (100 Hz filtro de alta freqüência, de 50 Hz filtro notch, 100.000 x amplificação), utilizando um RPS312RM Amplifier Grass. Tente filtrar frequências possíveis perturbadores que possam perturbar o sinal. A fim de processar os dados, use uma placa de aquisição analógico-digitais de dados em um computador desktop (PC compatível).
5. Após o período de adaptação ao escuro sob perfusão constante, medir a amplitude do sinal elétrico até estáveis ​​amplitudes b-ondas são gravadas.
   NOTA: As amplitudes são consideradas estáveis ​​se cinco medições individuais chegar a um valor médio e desviar-se menos de 10%. Um bom exemplo de medições individuais é dada na Figura 1.
6. Para iniciar o teste, substituir o oxigénio puro por qualquer azoto puro (número de experiências individuais, n = 5) para testar a hipóxiaou 250 um glutamato (n = 5).
7. Grave as respostas elétricas a cada 5 min para 45 min.
8. Após o período de testes, aspergir as retinas com padrão médio saturada com oxigênio por 75 min e olhar para as mudanças da amplitude da onda-b. Esta é a fase de lavagem. Medir a amplitude da onda-b da calha do uma onda para o pico da onda b.
9. Para investigar o efeito de hipóxia ou glutamato no potencial de fotorreceptores em condições escotópicas, suprimir a onda b pela adição de 1 mM para a solução nutriente.
10. Após a gravação de um potencial estável de fotorreceptores durante 30 min, realizar o procedimento como antes, expondo as retinas de 45 min para as diferentes soluções de irrigação com aspartato 1 mM. Use o mesmo período de washout (passo 2.8), como mencionado anteriormente.

Análise 3. Dados

1. A fim de avaliar estatisticamente os dados, garantir uma distribuição normal para todos os dados, por exemplo, utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnovteste ^15.
2. Calcula-se a redução dos a- e b-amplitudes de onda em percentagens após a fase de exposição, em comparação com a última medição antes da exposição. Comparar a redução das amplitudes-ERG após 45 min - no final do período de exposição - a ERG medido antes da aplicação.
3. Comparar a onda a- e b- no final da fase de lavagem para a amplitude correspondente antes de exposição a estudar a possibilidade de recuperação.
4. Para a análise estatística, use o software estatístico JMP software ou software SPSS. Calcular dados ao longo como a média ± desvio padrão. Estime significado pelo teste estatístico adequado.
   NOTA: Estes testes podem ser diferentes dependendo do escopo experimental. Neste cenário, use t-pareado de Student.

Resultados

Após 1 hora de perfusão dos preparativos da retina com solução padrão saturado de oxigênio (Figura 1A e B) ERG-amplitudes mostrou estabilização e menor variação de amplitudes entre as medidas individuais. pH, pressão osmótica, temperatura, e pO ₂ (excepto para o teste de hipóxia) foram mantidas constantes em todos os testes.

Para isolar o sinal a partir do sinal de fotorreceptores da retina interna, aspartato 1 mM foi adicionado para a solução padrão ...

Discussão

Neste estudo, um impacto significativo na amplitude da onda b após 45 minutos de hipoxia foi encontrado. Esta redução foi ainda significativo após a fase de washout. Um efeito semelhante sobre o potencial de fotorreceptores pode ser observada.

Os resultados são compatíveis com outros dados publicados ¹⁶ e nos dão a oportunidade de estudar possíveis efeitos neuroprotetores após hipóxia.

Depois de 45 minutos de exposição de 250 uM de glutamat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000