גלוטמט והיפוקסיה כמודל מתח לperfused חוליות הרשתית מבודדת

Summary

עם מחקר זה, אנו מציגים מודל מתח סטנדרטי לרשתית שור superfused המבודדת לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד. ההשפעה או היפוקסיה (N הטהור ₂₎ או מתח גלוטמט (250 גלוטמט מיקרומטר) על תפקוד רשתית מיוצג על ידי a- ואמפליטודות ב-גל הוערכה.

Abstract

Neuroprotection היה שדה חזק של חקירה במחקר רפואת עיניים בעשורים האחרונים ומשפיע מחלות כגון גלאוקומה, חסימת כלי דם ברשתית, היפרדות רשתית, ורטינופתיה סוכרתית. זה היה מושא מחקר זו כדי להציג מודל מתח סטנדרטי לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד.

רשתיות שור הוכנו וperfused עם פתרון סטנדרטי חמצן רווי, וERG נרשם. לאחר ההקלטה ב-גלים יציבים, היפוקסיה (N הטהור ₂₎ או מתח גלוטמט (250 מיקרומטר גלוטמט) שהופעל במשך 45 דקות. כדי לחקור את ההשפעות על תפקוד קולטי אור לבד, 1 aspartate מ"מ נוסף לקבלת-גלים. ERG-התאוששות הייתה פיקוח על 75 דקות.

להיפוקסיה, ירידה בגל משרעת של 87.0% נרשמה (p <0.01) לאחר זמן אקספוזיציה של 45 דקות (ירידה בשיעור של 36.5% לאחר תום p כישלון = 0.03). בנוסף, decr ראשונילהקל באמפליטודות ב-גל של 87.23% נרשמו, שהגיעה למובהקות סטטיסטיות (p <0.01, ירידה בשיעור של 25.5% בסוף השטיפה, p = 0.03).

עבור 250 מיקרומטר גלוטמט, ירידה של 7.8% ראשוני של אמפליטודות-גל (p> 0.05) ואחריו ירידה של 1.9% (p> 0.05). ירידה של 83.7% מאמפליטודות ב-גל (p <0.01) צוין; לאחר כישלון של 75 דקות הירידה הייתה 2.3% (p = 0.62). במחקר זה, מודל מתח סטנדרטי מוצג שעשוי להיות שימושי כדי לזהות השפעות נוירו אפשריות בעתיד.

Introduction

Neuroprotection היה שדה חזק של חקירה במחקר רפואת עיניים בעשורים האחרונים. הרשתית היא רשת עצבית רגישה מאוד שתלוי באופן משמעותי בחמצון ומושפע במידה רבה על ידי חילוף החומרים של תאים המקיפים אותה. פתולוגיות עיניות עיקריות הקשורות לנזק לתאי עצב הן חסימות כלי דם ברשתית, גלאוקומה, והיפרדות רשתית.

חסימת עורק רשתית, כדוגמא לחסימה של כלי דם ברשתית, מובילה לאובדן פתאומי של ראייה בשל חוסר חמצן של הרשתית הפנימית ^1. היא קשורה לעתים קרובות עם פתולוגיות כלליות של כלי דם ² ומובילים לאובדן ראייה מתמשך ^1, עם רק 8% מהחולים מתאוששים חדות ראייה באופן משמעותי ^1. למרות הפירוק פיברין עורקים הוצע כאפשרות טיפול, התועלת לא ניתן לראות בניסוי קליני אקראי ^3.

גלאוקומה והיפרדות רשתיתלשניהם יש עלייה בריכוז הגלוטמט ^4-6. גלוטמט בתנאים פיסיולוגיים הוא נתקל כמשדר מעורר בכל מערכת העצבים המרכזית וכל ^7,8 הרשתית הפנימית. רמות גבוהות גלוטמט נמצאו לא רק בגלאוקומה והיפרדות רשתית ^5,6 אלא גם ברטינופתיה סוכרתית שגשוג ^9. עלייה בגלוטמט אולי מובילה להפעלת יתר רעילה, ולכן, תאי עצב נזק ^10. ברוב המקרים של היפרדות רשתית ובמקרים מסוימים של ניתוח שגשוג רטינופתיה סוכרתי ברשתית (vitrectomy Plana pars) הם הכרחיים. במהלך המניפולציה מכאנית vitrectomy Plana סעיפים, אור הבהיר של הסיבים האופטיים או מאמץ גזירה המופעל על ידי ספיקות גבוהות של פתרונות השקיה במהלך פעילות ארוכה להפעיל לחץ נוסף על ^11,12 הרשתית.

כל המחלות שהוזכרו במשותף שפתולוגיה היא מקומית לרטיןלבד ומהווים קהילת ophthalmologic עם האתגר למצוא דרכים להגן על הרשתית כמערכת נוירו.

Electroretinogram (ERG) הוא השיטה סטנדרטית להערכת in vivo פונקצית קולטי אור (גל) והפונקציה של הרשתית הפנימית (ב-גל). ERG נמדד בכסף-אלקטרודות הציגו לתוך הקרנית והעיניים נמצאות מגורה על ידי רמה הולך וגדל של אור כדי לזהות פגמים במוטות או קונוסים או ברשתית הפנימית. פגמים שונים ברשתית יכולים להיות מזוהים על ידי שינויים במשרעת (עוצמת התגובה) או חביון (תגובה-מרווח זמן ל) של ERG. שיטות פרוטוקול ומדידת ERG שונות (דפוס-ERG, multifocal-ERG או שדה בהיר ERG) מאפשרים בידול נוסף של פגמים. הטכניקה של הרשתית המבודדת כבר הציגה לאחרונה, כך שניתן לבדוק את ההשפעות על הרשתית ללא הפרעות מלמשל בעלי חיים מחקר שלתגובות כלליות ^13,14.

זה היה מטרת מחקר זה להעריך ולהציג את מודל מתח מוגדר ואחיד להיפוקסיה ומתח גלוטמט על הרשתית המבודדת superfused. לפיכך, אנו מקווים להניח את היסודות למחקרים עתידיים על השפעות נוירו של סוכנים מסוימים או פתרונות השקיה התוך עיני.

Protocol

1. הכנת עיני שור

1. השג עיני שור ישירות לאחר החיה שנשחטה.
2. להעביר את העיניים מוגנות ב" Sickel-פתרון "בינוני מיוחד המכיל 120 mM NaCl, KCl 2 מ"מ, 0.1 מ"מ MgCl _2, 0.15 מ"מ CaCl _2, 1.5 מ"מ לאא ₂ גלוקוז מ"מ ₄ PO, 13.5 מ"מ Na ₂ HPO ₄ ו -5 ב RT.
3. לבצע את ההכנה של הרשתית בתנאים מותאמים כהים עם אור אדום עמום.
4. הסר את החלק הקדמי של העין. בצע בערך חתך משווני אחורי 4 מ"מ לימבוס. לאחר מכן להסיר את הקרנית, קשתית, גוף הריסים ועדשה בחתיכה אחת. שמור את הרשתיות בSickel-פתרון.
5. מכאני לשחרר קבצים מצורפים זגוגית אל פני השטח הרשתית והזגוגית להסיר מכוס עין הפתוחה.
6. לאחר מכן מחלק את העין לארבעה רבעים ואגרוף החוצה עגול אזורים של CA. 7 מ"מ קוטר באמצעות מקדחה.
7. בעדינות להפריד את הרשתיתמאפיתל הפיגמנט ולמקם אותו על מכשיר הקלטה בתוך קופסא המוגנת מפני אור. מכשיר ההקלטה מורכב ממתחזק פלסטיק עם רשת באמצע; למקם את הרשתית ברשת ולאחר מכן לתקן עם טבעת פלסטיק ישירות על האלקטרודות.
   הערה: יש מתחזק הפלסטיק שני ערוצים כדי לאפשר זרימה מתמדת של המדיום.

2. הקלטה electroretinogram (ERG)

1. על מנת לרשום electroretinogram, להשתמש בשתי אלקטרודות כסף / כסף-כלוריד בכל צד של הרשתית וינקב הרשתית במהירות זלוף קבועה של CA. 1 מיליליטר / דקה וטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. השתמש ב" Sickel-הפתרון "רווי בחמצן.
2. לפני שמתחיל את המדידה, כהה להתאים את הרשתית (להגן עליו מפני אור במהלך כל המדידות) ולהשתמש במרווחים של חמש דקות גירוי. השתמש בבזק 1 הרץ יחיד לבן קסנון לגירוי בעוצמה מוגדרת 6.3 MLX על פני השטח הרשתית.
3. שימוש מכויל מסנני צפיפות ניטראליים וגירוי אור של 10 μsec נשלט על ידי שעון עצר כדי שתהיה לי תגובות אופטימליות.
4. כדי למדוד ולעבד את הנתונים, לסנן ERG ומגביר אותו (מסנן high pass 100 הרץ, 50 מסנן חריץ הרץ, 100,000 x הגברה) באמצעות דשא RPS312RM מגבר. נסה לסנן תדרים מטרידים אפשריים שעלולים להפריע לאות. כדי לעבד את הנתונים, השתמש רכישת לוח אנלוגי לדיגיטלי נתונים במחשב שולחני (PC תואם).
5. לאחר תקופת ההסתגלות הכהה מנות קבועות, למדוד את אמפליטודות של האות החשמלי עד אמפליטודות ב-גל יציב נרשמת.
   הערה: אמפליטודות נחשבת יציבה אם חמש מדידות יחידים להגיע לערך ממוצע ולסטות פחות מ -10%. דוגמא טובה למדידות בודדות ניתנת באיור 1.
6. כדי להפעיל את הבדיקה, להחליף חמצן טהור או על ידי חנקן טהור (מספר הניסויים בודדים, n = 5) לבדיקת היפוקסיהאו גלוטמט מיקרומטר 250 (n = 5).
7. רשום את התגובות חשמליות כל 5 דקות במשך 45 דקות.
8. לאחר תקופת הבדיקה, תנקב את הרשתיות עם מדיום סטנדרטי רווי בחמצן במשך 75 דקות ומסתכלים על השינויים של משרעת ב-הגל. זהו שלב השטיפה. מדוד את משרעת ב-גל מהשפל של הגל לשיא של ב-הגל.
9. כדי לחקור את ההשפעה של היפוקסיה או גלוטמט על פוטנציאל קולטי האור בתנאי scotopic, לדכא ב-הגל על ​​ידי הוספת 1 מ"מ לפתרון התזונתי.
10. לאחר הקלטת פוטנציאל קולטי אור יציב למשך 30 דקות, לבצע את ההליך כמו קודם, חושף את הרשתיות 45 דקות לפתרונות השקיה השונות עם 1 מ"מ aspartate. השתמש באותה תקופה מתנה (שלב 2.8) כאמור.

ניתוח 3. נתונים

1. על מנת להעריך סטטיסטית את הנתונים, להבטיח התפלגות נורמלית לכל הנתונים, למשל באמצעות קולמוגורוב-סמירנובבדיקה ^15.
2. לחשב את הפחתת עוצמות a- וb-גל באחוזים לאחר שלב החשיפה בהשוואה למדידה האחרונה לפני התערוכה. השווה את ההפחתה של ERG-אמפליטודות לאחר 45 דק '- בסוף תקופת התערוכה - לERG נמדדה לפני היישום.
3. השווה את גל a- וb- בסוף שלב השטיפה למשרעת המקבילה לפני התערוכה לבחון התאוששות אפשרית.
4. לניתוח סטטיסטי, להשתמש בתוכנת תוכנת JMP הסטטיסטית או תוכנת SPSS. לחשב נתונים לאורך כממוצע ± סטיית תקן. להעריך את משמעות על-פי המבחן הסטטיסטי המתאים.
   הערה: בדיקות אלה עשויות להיות שונות, בהתאם להיקף ניסיוני. בהגדרה זו, להשתמש במבחן t המזווג של הסטודנט.

תוצאות

אחרי שעה 1 של זלוף של הכנות רשתית עם פתרון רווי חמצן סטנדרטי (איור 1 א 'וב') ERG-אמפליטודות הראתה התייצבות ופחות וריאציה של אמפליטודות בין מדידות בודדות. pH, לחץ האוסמוטי, טמפרטורה, וPO ₂ (פרט לבדיקות היפוקסיה) נשמרו קבועים לכל הבדיקות.

Discussion

במחקר זה, יש השפעה משמעותית על משרעת ב-הגל לאחר 45 דקות של חוסר חמצן נמצאה. הפחתה זו עדיין הייתה משמעותית לאחר שלב השטיפה. השפעה דומה על פוטנציאל קולטי האור יכולה להיות שנצפתה.

התוצאות נתמכות על ידי נתונים אחרים שפורסמו ¹⁶ ולתת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000