Glutamate et hypoxie comme un modèle de stress pour la isolé perfusé vertébrés Retina

Résumé

Avec cette étude, nous présentons un modèle de stress standardisé pour la rétine bovine superfusé isolée pour l'avenir essais thérapeutiques précliniques. L'effet de l'hypoxie soit (N ₂ pur) ou le stress de glutamate (250 uM de glutamate) sur la fonction rétinienne représenté par a et b amplitudes d'onde a été évaluée.

Résumé

Neuroprotection a été un fort champ d'investigation dans la recherche ophtalmologique dans les dernières décennies et affecte maladies comme le glaucome, une occlusion vasculaire rétinienne, décollement de la rétine, et la rétinopathie diabétique. Ce était l'objet de cette étude d'introduire un modèle de stress normalisé pour les futurs essais thérapeutiques précliniques.

Rétines bovins ont été préparés et perfusés avec une solution standard d'oxygène saturé, et l'ERG a été enregistré. Après l'enregistrement B-ondes stables, l'hypoxie (N ₂₎ pur ou un stress du glutamate (250 um de glutamate) a été exercée pendant 45 min. Pour étudier les effets sur la fonction des photorécepteurs seul, 1 mM aspartate a été ajouté pour obtenir un-ondes. ERG recouvrement a été suivie pendant 75 min.

Pour une hypoxie, une diminution de l'amplitude d'une onde de 87,0% a été notée (p <0,01) après un temps d'exposition de 45 min (diminution de 36,5% après la fin du lavage p = 0,03). En outre, un dim initialefacilité dans amplitudes b-ondes de 87,23% a été enregistrée, qui a atteint la signification statistique (p <0,01, baisse de 25,5% à la fin de l'affouillement, p = 0,03).

Pour 250 um glutamate, une première réduction de l'amplitude d'onde un (p> 0,05), suivie par une réduction de 1,9% (p> 0,05) de 7,8%. Une réduction de 83,7% des amplitudes d'onde (b p <0,01) a été notée; après un lavage de 75 min, la réduction a été de 2,3% (p = 0,62). Dans cette étude, un modèle de stress standardisé est présenté qui peut être utile pour identifier les effets neuroprotecteurs possibles à l'avenir.

Introduction

Neuroprotection a été un fort champ d'investigation dans la recherche ophtalmologique dans les dernières décennies. La rétine est un réseau neuronal très sensible qui dépend de manière significative sur l'oxygénation et est fortement influencé par le métabolisme de ses cellules environnantes. Pathologies oculaires majeurs liés aux dommages de cellules nerveuses rétiniennes sont occlusions vasculaires, le glaucome, et décollement de la rétine.

Occlusion de l'artère rétinienne, comme un exemple pour occlusion vasculaire rétinienne, conduit à une perte soudaine de la vision due à l'hypoxie de la rétine interne ^1. Elle est souvent associée à des pathologies vasculaires générales ² et conduit à une perte visuelle persistante ^1, avec seulement 8% des patients qui se remettent de façon significative ^une acuité visuelle. Bien que la fibrinolyse artérielle a été suggéré comme une option de traitement, le bénéfice n'a pas pu être montré dans un essai clinique randomisé ^3.

Le glaucome et décollement de la rétineont tous deux une augmentation de la concentration de glutamate ^6.4. Glutamate dans des conditions physiologiques est rencontré comme un transmetteur excitateur dans tout le système nerveux central et le ^7,8 rétine interne. Niveaux élevés de glutamate ont été trouvés non seulement dans le glaucome et décollement de la rétine ^5,6 mais aussi dans la rétinopathie diabétique proliférante ^neuf. Une augmentation de glutamate conduit éventuellement à l'excitotoxicité et, par conséquent, des lésions des cellules nerveuses ^10. Dans la plupart des cas de décollement de la rétine et dans certains cas de la chirurgie de la rétinopathie diabétique proliférante sur la rétine (vitrectomie pars plana) sont nécessaires. Pendant pars plana vitrectomie manipulation mécanique, la lumière vive de la fibre optique ou contrainte de cisaillement exercée par des débits élevés de solutions d'irrigation pendant de longues opérations exercent un stress supplémentaire sur la rétine ^11,12.

Toutes les maladies mentionnées ont en commun que la pathologie est localisée à la rétineun seul et pose la communauté ophtalmologique au défi de trouver des moyens pour protéger la rétine comme un système neurosensoriel.

L'électrorétinogramme (ERG) est la méthode standard pour l'évaluation in vivo la fonction des photorécepteurs (a-ondes) et la fonction de la rétine interne (b-ondes). L'ERG est mesurée par Silver-électrodes introduites dans la cornée et les yeux sont stimulées par une augmentation du niveau de la lumière pour détecter des défauts dans des tiges ou des cônes ou dans la rétine interne. Différents défauts de la rétine peuvent être détectées par des changements dans l'amplitude (la force de la réponse) ou la latence (la réponse-à-intervalle de temps-) de l'ERG. Protocole et méthodes de mesure différentes ERG (pattern-ERG, multifocale-ERG ou champ clair ERG) permettent une différenciation plus poussée des défauts. La technique de la rétine isolée a été introduit récemment, ce qui permet d'évaluer les effets sur la rétine sans interférences d'un animal, par exemple de l'étude de^13,14 réactions générales.

Ce était le but de cette étude pour évaluer et mettre en place un modèle de stress défini et normalisé pour l'hypoxie et le stress de glutamate sur la rétine isolée superfusées. Ainsi, nous espérons jeter les bases pour de futures études sur les effets neuroprotecteurs de certains agents ou des solutions d'irrigation intraoculaires.

Protocole

1. Préparation des yeux de bovins

1. Obtenir yeux bovins directement après que l'animal est abattu.
2. Transporter les yeux protégées "Sickel-solution" un milieu spécial contenant 120 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 0,1 mM de _MgCl2, 0,15 mM de _CaCl2, 1,5 mM de NaH ₂ PO _4, 13,5 mM de Na ₂ HPO ₄ et 5 mM de glucose à RT.
3. Effectuer la préparation de la rétine dans des conditions adaptées sombres avec une lumière rouge sombre.
4. Retirer la partie antérieure de l'œil. Effectuer une incision ca. équatoriale 4 mm en arrière du limbe. Par la suite retirer cornée, l'iris, le corps ciliaire et la lentille en un seul morceau. Gardez les rétines dans Sickel-solution.
5. Desserrer mécaniquement les pièces jointes vitreux à la surface de la rétine et du vitré retirer de la coupe de l'oeil ouvert.
6. Ensuite diviser l'œil en quatre quadrants et punch out ronde domaines de ca. 7 mm de diamètre en utilisant un trépan.
7. Séparez délicatement la rétineà partir de l'épithélium pigmentaire et la placer sur un dispositif d'enregistrement à l'intérieur d'une boîte à l'abri de la lumière. Le dispositif d'enregistrement est constitué d'un mainteneur plastique à ouverture de maille dans le milieu; placer la rétine sur le maillage, puis fixer avec un anneau en plastique directement sur les électrodes.
   NOTE: Le mainteneur plastique a deux canaux pour permettre un flux constant du milieu.

2. Enregistrement du Électrorétinogramme (ERG)

1. Afin d'enregistrer l'électrorétinogramme, utiliser deux électrodes argent / chlorure d'argent de chaque côté de la rétine et perfuser la rétine à une vitesse de perfusion constante de ca. 1 ml / min et la température constante de 37 ° C. Utilisez le "Sickel-solution" saturée en oxygène.
2. Avant de commencer la mesure, adapter sombre la rétine (la protéger de la lumière pendant toutes les mesures) et utiliser des intervalles de relance de cinq minutes. Utilisez un 1 Hz seul flash au xénon blanc pour la stimulation avec une intensité réglée sur 6,3 mlx à la surface de la rétine.
3. Utilisez calibré filtres de densité neutre et un stimulus lumineux de 10 microsecondes contrôlée par une minuterie afin d'avoir des réponses optimales.
4. Pour mesurer et traiter les données, filtrer l'ERG et l'amplifier (100 Hz filtre passe-haut, 50 Hz filtre notch, 100 000 x amplification) en utilisant un amplificateur RPS312RM Herbe. Essayez de filtrer les fréquences perturbatrices possibles qui peuvent perturber le signal. Afin de traiter les données, utiliser une carte d'acquisition analogique-numérique des données sur un ordinateur de bureau (PC compatible).
5. Après la période d'adaptation à l'obscurité sous perfusion constante, mesurer les amplitudes du signal électrique jusqu'à ce amplitudes b-ondes stables sont enregistrées.
   NOTE: Les amplitudes sont considérés comme stable si cinq mesures simples atteignent une valeur moyenne et écartent moins de 10%. Un bon exemple de mesures individuelles est donnée à la figure 1.
6. Pour commencer le test, remplacer l'oxygène pur soit par de l'azote pur (nombre d'expériences simples, n = 5) pour tester l'hypoxieou glutamate 250 um (n = 5).
7. Notez les réponses électriques toutes les 5 min pendant 45 min.
8. Après la période d'essai, perfuser les rétines avec un milieu standard saturé avec l'oxygène pendant 75 minutes et regarder les changements de l'amplitude de l'onde b. Ce est la phase lavage. Mesurer l'amplitude de l'onde b de l'auge de l'un vague à l'apogée de la b-ondes.
9. Pour étudier l'effet de l'hypoxie ou glutamate sur le potentiel de photorécepteur dans des conditions scotopiques, supprimer l'onde b en ajoutant 1 mM à la solution nutritive.
10. Après l'enregistrement d'un potentiel de photorécepteur stable pendant 30 min, effectuer la procédure comme avant, exposant les rétines 45 min aux différentes solutions d'irrigation avec 1 mM aspartate. Utilisez la même période de lavage (étape 2.8) tel que mentionné précédemment.

3. Analyse des données

1. Afin d'évaluer statistiquement les données, assurer une distribution normale pour toutes les données, par exemple en utilisant le Kolmogorov-Smirnovessai de ^15.
2. Calculer la réduction des a- et B-ondes amplitudes en pourcentages après la phase d'exposition par rapport à la dernière mesure avant l'exposition. Comparer la réduction de l'Erg-amplitudes après 45 min - à la fin de la période d'exposition - à ERG mesurée avant l'application.
3. Comparer l'onde a- et b- à la fin de la phase de lavage à l'amplitude correspondante avant exposition à examiner une récupération possible.
4. Pour l'analyse statistique, utilisez le logiciel JMP logiciel statistique ou le logiciel SPSS. Calculer des données dans l'ensemble en tant que moyenne ± écart-type. Estimer la signification par le test statistique approprié.
   NOTE: Ces tests peuvent être différents en fonction de la portée expérimentale. Dans ce cadre, utilisez t-test apparié de Student.

Résultats

Après 1 heure de la perfusion de la préparation de la rétine avec la solution étalon saturée en oxygène (figure 1A et B) ERG-amplitudes ont montré stabilisation et moins de variations d'amplitudes entre les mesures simples. le pH, la pression osmotique, la température et la pO ₂ (sauf pour l'essai de l'hypoxie) ont été maintenues constantes pour tous les tests.

Pour isoler le signal de photorécepteur à partir du signal de la rétine interne, 1...

Discussion

Dans cette étude, un impact significatif sur l'amplitude de l'onde b après 45 min de l'hypoxie a été trouvé. Cette réduction était encore significative après la phase de lavage. Un effet similaire sur le potentiel de photorécepteur a pu être observée.

Les résultats sont corroborés par d'autres données publiées et de ¹⁶ nous donner la possibilité d'étudier des effets neuroprotecteurs possibles après l'hypoxie.

A...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000