纤毛对小鼠的主要嗅觉系统整装标签

摘要

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

摘要

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

引言

鼻腔鼠标嗅上皮包括6-10万双极嗅感觉神经元^1。每个嗅觉神经元选择的1200气味受体基因的表达之一。检测加臭剂的开始由气味结合到嗅觉受体^2，其然后激活腺苷酸环化酶III型^（ACIII）3经由嗅觉特异性G蛋白_GαOLF ^4。由此而造成的环磷酸腺苷（cAMP）打开一个环核苷酸门控（CNG），非选择性阳离子通道，导致^钙离子和^钠离子，并随后钙涌入²⁺内流导致开口的Ca ²⁺活化的Cl ^-通道^5,6。所得向外Cl ^-的磁通变得容易通过高细胞内氯^-吸收，有可能通过的Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^-的^-协同转运NKCC1中，通过稳定氯浓度保持CL ^- / HCO3 ^-换热器SLC4A1，也许更多的尚未确定运输^6-8。

双极嗅觉神经元具有单一的，无支链的轴突直接投射到嗅球和树枝状延伸到上皮的表面和端部作为专门隔室，树枝状旋钮。从这个旋钮，10-30纤毛，其可以达到50-60微米的长度，发出入粘液覆盖的上皮表面^9。规范化的信号转导级联的蛋白质主要定位于这些纤毛的膜。上皮的增加感官表面放大，以检测气味物质的能力。由于感觉神经元的密度，纤毛从相邻的树突旋钮延伸弄乱。这种交织的结果是从不同的神经元，表达不同类型的嗅觉受体，上皮的表面上的随机混合物纤毛。的检测和细胞睫状蛋白，只存在于感觉神经元的一个子集的ular分配，因此在冷冻切片困难。另外，这种蛋白质沿纤毛的精确定位是几乎不可能的，因为冷冻切片通常比纤毛的平均长度薄。

为了使在嗅觉神经元至今未鉴定的膜蛋白的纤毛本土化的调查中，我们优化的恩面对制剂技术，它允许蛋白定位于纤毛的详细分析。简言之，将小鼠处死并在头分割中线附近。鼻甲，鼻，和额叶骨骼被去除以暴露隔膜。用的衬里上皮嗅觉部隔膜通过切割所有连接到鼻腔松开。把隔膜变成培养皿充满林格氏液后，将上皮剥离UND转移到涂覆的玻璃载片。经过简短fixat离子一步，免疫组化方法可以如果操作尽可能轻柔，以免脆弱的组织损伤进行。我们证明在古典冷冻切片和中所描述的连接面制备比较两种不同的膜蛋白的染色在嗅觉纤毛可达到的分辨率。

研究方案

注:所有动物的程序都在查理特大学或诊所耶拿符合德国动物保护的法律，避免动物的任何不必要的痛苦处理。

1.准备解决方案和解剖职场

1. 解决方案
   注:在开始上皮剥离之前，请准备以下解决方案。
   1. 在解剖过程的解决方案:
      1. 制备林格氏液（pH7.4）中为140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，10mM的HEPES，2mM的_氯化钙 ，1mM的MgCl ₂的，和10mM葡萄糖的浓度。
      2. 制备的PBS ^{- / -}溶液（pH 7.4）以2.68毫米氯化钾，1.47毫KH ₂ PO _4，136 mM氯化钠，和8.1毫摩尔的Na ₂ HPO ₄的浓度。
      3. 制备固定剂溶液（pH 7.2）与浓度的1×PBS的^{- / -} ，0.2mM的_氯化钙 ，4％蔗糖，4％的多聚甲醛。蔗糖在固定液提高低温切片和回升冰冻切片的。存储在-20℃。
   2. 用于染色过程的解决方案
      1. 准备PBS ^{+ / +}解决方案与1X PBS的浓度^{- / - ， -} 0.48毫米氯化镁_2，0.9毫米氯化钙_2。
      2. 准备PBST ^{+ / +}解决方案与1X PBS ^{+ / +} 0.1％的Triton X-100的浓度。
      3. 制备用1×PBST ^{+ / +}和1％明胶的浓度封闭溶液。
2. 职场
   1. 用于夹层的工作场所中，使用解剖显微镜用明亮的照明，以及一个液体阻滞剂笔。
   2. 准备一个培养皿，充满林格氏溶液，和粘合剂载玻片。
   3. 得到如下手术器械:一对手术剪一个尖锐的和一个钝头，一双弹簧剪刀直笔尖形状，双钳细尖弧形形状和剃刀刀片（ 图1A）。

2.准备鼻中隔

1. 房子的动物在笼子里批准定期获得食物和水，适当的昼/夜循环。
2. 在一个封闭的容器含有纱布通过测试后足部反射浸泡100％，异氟醚和显示器镇痛麻醉进行。由于颈椎脱位可引起血鼻腔，直接斩首麻醉小鼠。
3. 取下皮肤，露出整个颅骨和鼻子的骨，并彻底用纸巾擦去剩余的血液和组织。取出下颌前牙。
4. 切开鼻子的背侧骨双边在1-2毫米的距离平行于缝合线的隔垫（内侧）的一侧，从上颌骨（横向）分开。分裂的鼻子跟单切。如果残存骨骼和鼻甲仍附着于隔，去除这些精心完全暴露隔而不触及它。
5. 由滑动的钳子沿着该隔膜的背侧细弯曲尖，隔膜和鼻骨之间移除背鼻骨。适用于轻微的压力，骨头，推起来，将其删除。
6. 以提供从每个空腔访问两个隔组织，1，小心地取出头的另一侧的上颌骨。当准备年长的动物（P> 28），除去额骨覆盖嗅球的一角。
7. 由它的微黄色的颜色（ 图1B）确定嗅觉上皮。接壤呼吸道上皮是白色的，表明运动纤毛可在解剖显微镜下可见的移动。沿嗅和呼吸道上皮的交界带双鸟语花香剪刀剪。
8. 延长削减和到犁骨腹连接分开隔。然后沿隔和OS筛的筛板之间的边界切即隔膜现在已经完全从所有连接到头部隔离。使用图1C中所示的切割位置。

3.隔离嗅觉上皮细胞的免疫染色

1. 放置在培养皿中充满林格氏溶液的粘合剂载玻片。将其放置到陪替氏培养皿的边缘上，以使一个半玻璃在于林格氏溶液（ 图1A）。
2. 使用镊子的嗅觉上皮仔细转移筛骨到陪替氏培养皿中。抬起不与镊子尖端抓住它。
3. 抢筛骨垂直板有一个镊子，并使用第二个要小心地从隔的一侧取出上皮。滑动垂直板和上皮细胞之间的弧形尖剥离脱落上皮。
4. 总是一定要识别睫状侧，万一上皮翻转在林格氏soluti上。如果上皮翻转，这是几乎不可能事后识别睫状侧。大多数情况下，上皮细胞卷起里面的纤毛表面。
5. 与图1C中所示的切割位置进行比较的登记组织的形状。抢在上皮在边境的位置，并将其拉至载玻片。请勿触摸纤毛侧镊子，避免组织损伤。
6. 转动隔膜并与来自另一侧的上皮重复该过程。
7. 干燥围绕两件的嗅觉上皮用纸巾载玻片并环绕与液体阻滞剂笔的组织。
8. 固定带在室温10分钟150μl的固定液的组织。关于纤毛的稳定性和完整性，使用短的固定时间用于各种测试抗体。在这10分钟纤毛是固定的，但可能不是全部的上皮组织。因此，随着在S之后的显微镜直接可视泰宁程序。然而，固定液时间可能有所不同个体抗体。

4.染色协议

注:处理组织非常认真地保存嗅感觉神经元的纤毛结构。吹打删除解决方案。不要直接将任何解决方案到上皮细胞，机械力可能会破坏优良的纤毛。完成所有步骤在室温如果没有说明。

1. 除去固定液和洗涤2次，用PBS ^{+ / +。}
2. 孵育上皮至少1小时，以封闭液。
3. 离心5分钟以全速以除去任何沉淀物:通过在封闭液（200为在该研究中使用的抗体1）溶​​解该抗体制备第一抗体溶液。
4. 孵育在潮湿室中在4℃CO / N抗体溶液的上皮。
5. 洗涤上皮用PBS ^{+ / +} 5分钟，在至少3次。
6. 离心5分钟，在全速:通过在封闭溶液（500 1）将所述抗体制备二级抗体溶液。
7. 孵育在黑暗腔室1小时的第二抗体溶液中的上皮。
8. 洗涤上皮用PBS ^{+ / +} 5分钟，在至少3次。
9. 用刀片或纸巾除去液体阻滞剂。洗用蒸馏水上皮为5秒。
10. 保护组织抗淬灭安装试剂。
    注:在几天内背景荧光迅速增大;因此显微分析中安装嵌入后不迟于2日内建议。特别注意有寻找正确的焦平面时，挤压组织，因为它会严重损坏准备采取没有。由于离焦的荧光，进一步调查，共焦显微镜，推荐。

结果

嗅觉上皮连接面制剂可以用于研究蛋白质的定位中的感觉神经元的纤毛，使蛋白质的详细调查，其定位是冷冻切片的分析后不清楚。这个问题可以例举在染色IRRE样蛋白2（Kirrel2）的健的情况下。 Kirrel2（也称为Neph3）是膜蛋白和功能的免疫球蛋白（Ig）超家族的同嗜粘附蛋白中的一员。它显示出在嗅觉系统中轴突引导的作用，并表达在嗅觉神经元的活性依赖性方式¹⁰的子集。

讨论

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood