הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

Summary

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Abstract

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Introduction

אפיתל ריח העכבר בחלל האף כולל 6-10,000,000 עצב סנסורי חוש הריח דו קוטבי ^1. כל נוירון חוש הריח בוחר אחד של 1,200 גני קולט odorant לביטוי. איתור של odorants מתחיל בodorant מחייב קולטני ריח ^2, אשר לאחר מכן מפעיל cyclase adenylyl סוג III (ACIII) ³ דרך חלבון G הספציפי Gα חוש הריח _olf ^4. העלייה וכתוצאה מכך monophosphate המחזורית אדנוזין (cAMP) פותחת מחזורי (CNG), ערוץ קטיון לא סלקטיבי שהוביל לזרם של Ca ^{2 +} וNa ^+, ולאחר מכן Ca מגודרת נוקלאוטיד ^{2 +} זרם מוביל לפתיחת Cl Ca ^{2 +} מופעל ^- ערוץ ^5,6. וכתוצאה מכך כלפי חוץ Cl ^- השטף הוא הקל על ידי Cl תאיים גבוה ^- ריכוז מתוחזק על ידי Cl היציב ^- ספיגה, סביר להניח באמצעות Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^- NKCC1 cotransporter,Cl ^- / HCO3 ^- SLC4A1 מחליף, ומובילים עדיין להיות מזוהים אולי נוספים ^6-8.

יש נוירונים חוש הריח דו קוטביים אקסונים בודדים, unbranched שמקרינים ישירות לנורת חוש הריח, ודנדריט שמשתרע על פני השטח של האפיתל ומסתיים כתא מיוחד, הידית דנדריטים. מהכפתור הזה, 10-30 cilia, שיכול להגיע לאורך של עד 50-60 מיקרומטר, נובע לריר המכסה את פני השטח האפיתל ^9. חלבונים של המפל הולך אותות הקנונים הם מקומיים בעיקר בקרום של cilia אלה. המשטח החושי המוגבר של האפיתל מגביר את היכולת לזהות odorants. עקב הצפיפות של עצב סנסורי, cilia המשתרע מידיות דנדריטים שכנות להתערבב. כך מצויים בתערובת אקראית של cilia מתאי עצב שונה, המבטאים סוגים שונים של קולטני ריח, על פני השטח של האפיתל. האיתור והתאהקצאת רגילה של חלבוני הריסים אשר נמצאים רק בתת-קבוצה של תאי עצב תחושתיים היא קשה ולכן בcryosections. בנוסף, האיתור המדויק של חלבונים כגון לאורך הריסים הוא בקושי אפשרי, שכן cryosections הוא בדרך כלל דק יותר מהאורך הממוצע של cilia.

כדי לאפשר חקירה של לוקליזציה הריסים של חלבונים בממברנה עד כה uncharacterized בתאי עצב הרחה, אנו מותאמים en טכניקת הכנת פנים המאפשרת ניתוח מפורט של לוקליזציה חלבון בcilia. בקצרה, העכבר הוא הקריב והראש לפצל ליד קו האמצע. Turbinates, האף, ועצמות חזיתיות יוסרו כדי לחשוף את המחיצה. המחיצה עם חלק חוש הריח של האפיתל הבטנה הוא התיר על ידי חיתוך כל החיבורים לחלל האף. לאחר לשים את המחיצה לתוך צלחת פטרי מלא בפתרון של רינגר, האפיתל הוא קילף und הועבר לשקופיות זכוכית מצופים. בעקבות fixat קצרצעד יון, ניתן לבצע נהלי immunostaining אם הטיפול הוא עדין ככל האפשר, כדי למנוע נזק של רקמת הרירית. אנחנו מדגימים את הרזולוציה השגה על ידי השוואת ההכתמה של שני חלבוני קרום שונים בcilia חוש הריח בcryosections הקלאסי ובen הפנים ההכנה תיארה.

Protocol

הערה: כל נהלי בעלי החיים טופלו בCharité או אוניברסיטת מרפאת Jena בקנה אחד עם חוקים הגרמנים טיפול בבעלי חיים הימנעות מכל סבל מיותר של בעלי חיים.

1. פתרונות הכנה וDissection מקום עבודה

1. פתרונות
   הערה: הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת נתיחה של האפיתל.
   1. פתרונות להליך לנתיחה:
      1. הכן את הפתרון של רינגר (pH 7.4) עם ריכוזים של 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ CaCl _2, 1 מ"מ MgCl _2, ו -10 מ"מ גלוקוז.
      2. הכן PBS ^{- / -} פתרון (pH 7.4) עם ריכוזים של 2.68 מ"מ KCl, 1.47 מ"מ KH ₂ PO _4, 136 מ"מ NaCl, ו -8.1 מ"מ Na ₂ HPO _4.
      3. הכן פתרון מקבע (pH 7.2) עם ריכוזים של 1x PBS ^{- / -,} 0.2 מ"מ CaCl _2, סוכרוז 4%, וparaformaldehyde 4%. סוכרוז בפתרון מקבע משפר cryoחתך ואיסוף של cryosections. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
   2. פתרונות להליך מכתים
      1. הכן PBS ^{+ / +} פתרון עם ריכוזים של 1x PBS ^{- / -,} 0.48 מ"מ MgCl _2, 0.9 מ"מ CaCl _2.
      2. הכן PBST ^{+ / +} פתרון עם ריכוזים של 1x PBS ^{+ / +} ו -0.1% Triton X-100.
      3. הכן פתרון חסימה עם ריכוזים של 1x PBST ^{+ / +} ו -1% לטין.
2. מקום עבודה
   1. למקום העבודה לנתיחה, להשתמש מיקרוסקופ לנתח עם תאורה בהירה, כמו גם עט נוזלי בחסמי.
   2. הכן צלחת פטרי, מלא בפתרון של רינגר, ושקופיות זכוכית דבק.
   3. השג את מכשירי הניתוח הבאים: זוג מספריים כירורגית עם קצה קהה אחד חד ואחד, זוג מספריים אביב עם צורת קצה ישר, שני מלקחיים עם צורה עדינה מעוקלת קצה וסכין גילוח ( איור 1 א).

2. הכנת מחיצת האף

1. בעלי חיים בכלובים שאושרו בית עם גישה סדירה למזון ומים ומחזור היום / לילה מתאים.
2. לבצע הרדמה בגזת קיבול המכיל סגורה ספוגה עם isoflurane 100% ושיכוך כאבים צג על ידי בדיקת רפלקסים רגל אחורית. מאז נקע בצוואר הרחם יכול לגרום לדם בחללי האף, ישירות לערוף עכברים מורדמים.
3. הסר את העור כדי לחשוף את העצם של כל הגולגולת והאף, ולנגב את הדם ורקמות שנותר באמצעות מגבת נייר ביסודיות. הסר את הלסת ושיניים הקדמיות התחתונות.
4. לחתוך את עצם הגב של האף דו-צדדי במקביל מרחק 1-2 מ"מ לקו התפר כדי להפריד צד אחד של מחיצת האף (מדיאלית) מmaxilla (רוחבי). לפצל את האף עם חתך אחד. אם שרידי עצמות וturbinates עדיין מחוברים למחיצה, להסיר אלה בזהירות כדי לחשוף את המחיצה לחלוטיןמבלי לגעת בו.
5. הסר את עצם האף הגבי על ידי הזזה הקצה מעוגל הקנס של מלקחיים בצד הגב של מחיצת האף, בין המחיצה ועצם האף. להפעיל לחץ קל על העצם, לדחוף אותו ולהסיר אותו.
6. כדי לספק גישה לשתי רקמות במחיצה, אחד מכל חלל, להסיר בזהירות את maxilla של הצד של הראש האחר. בעת הכנת בעלי חיים מבוגרים (P> 28), להסיר את קצה העצם הקדמי מכסה את נורות חוש הריח.
7. זהה את אפיתל ההרחה על ידי הצבע הצהוב מעט (איור 1). אפיתל הנשימה הגובל הוא לבן ומראה תנועה של cilia ניעתי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח. לחתוך לאורך הגבול בין אפיתל הרחה ונשימה עם זוג מספריים אביב נאה.
8. להאריך את החתך ולהפריד את המחיצה מחיבור הגחון עד עצם vomer. ואז לחתוך לאורך הגבול בין המחיצה וcribrosa lamina של ethmoidal Osדואר. המחיצה כעת מבודדת לחלוטין מכל החיבורים לראש. השתמש בעמדות החיתוך שמוצגים באיור 1 ג.

3. בידוד של האפיתל חוש הריח לImmunostaining

1. הנח שקופיות זכוכית דבק בצלחת פטרי מלאים בפתרון של רינגר. מניחים אותו על הקצה של צלחת פטרי, כך שמחצית מהזכוכית טמונה בפתרון (איור 1 א) רינגר.
2. השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את עצם הכברה עם אפיתל ההרחה לצלחת פטרי. הרם אותו ללא תופס אותו עם הטיפים מלקחיים.
3. תפוס את הצלחת בניצב של העצם הכברה עם מלקחיים ולהשתמש שני אחת כדי להסיר בזהירות את האפיתל מצד אחד של מחיצת האף. חלק את הקצה המעוגל בין הצלחת ואפיתל בניצב לקלף את האפיתל מ.
4. להיות תמיד בטוח כדי לזהות את צד הריסים, במקרה אפיתל סלטות בsoluti רינגרעל. אם אפיתל סלטות, זה כמעט בלתי אפשרי לזהות את צד הריסים לאחר מכן. בעיקר, האפיתל מתגלגל עם משטח הריסים בפנים.
5. השווה את צורת הרקמה נרשמה עם עמדות החיתוך שמוצגים באיור 1 ג. תפוס את האפיתל בעמדה בגבול ולמשוך אותו לשקופית הזכוכית. אל תיגע בצד הריסים עם המלקחיים כדי למנוע נגעים של הרקמה.
6. הפעל מחץ ולחזור על התהליך עם אפיתל מהצד השני.
7. ייבש את שקופיות הזכוכית סביב שני החתיכות של אפיתל ריח עם מגבת נייר ולהקיף את הרקמה עם עט נוזלי בחסמי.
8. לתקן את הרקמה עם 150 פתרון מקבע μl 10 דקות ב RT. בנוגע ליציבות cilia ויושרה, להשתמש פעמים קיבעון קצרות עבור מגוון רחב של נוגדנים נבדקו. בתוך cilia 10 דקות אלה קבועים, אבל כנראה לא כל רקמת האפיתל. לפיכך, מיידי לדמיין עם מיקרוסקופ לאחר staining הליך. עם זאת, פעמים מקבע עשויות להשתנות לנוגדנים בודדים.

4. מכתים פרוטוקול

הערה: ידית הרקמה מאוד בזהירות כדי לשמור על מבני הריסים של עצב סנסורי חוש הריח. הסר פתרונות על ידי pipetting. אל תפיל את כל פתרונות ישירות על גבי האפיתל, ככוחות מכאניים יכולים לשבש את הריסים העדינים. לבצע את כל השלבים בRT אם לא צוין אחרת.

1. הסר את הפתרון מקבע ולשטוף 2 פעמים עם PBS ^{+ / +.}
2. דגירה אפיתל במשך שעה לפחות 1 עם חסימת פתרון.
3. הכן פתרון נוגדן ראשוני על ידי המסת הנוגדן בחסימת פתרון (1: 200 לנוגדנים המשמשים במחקר זה) וצנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות מלאה כדי להסיר כל משקעים.
4. דגירה אפיתל עם פתרון נוגדנים בתא לח על 4 מעלות CO / N.
5. אפיתל לשטוף עם PBS ^{+ / +} 5 דקות לפחות 3 פעמים.
6. הכן פתרון נוגדנים משני על ידי המסת הנוגדן בחסימת פתרון (1: 500) וצנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות מלאה.
7. דגירה אפיתל עם פתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בתא חשוך.
8. אפיתל לשטוף עם PBS ^{+ / +} 5 דקות לפחות 3 פעמים.
9. הסר את הנוזל בחסמי בסכין גילוח או מגבת נייר. שטוף את האפיתל במים מזוקקים למשך 5 s.
10. לשמר את הרקמה בantifade מגיב הרכבה.
    הערה: עליות הקרינה רקע במהירות בתוך ימים; ניתוח Microscopical לא יאוחר מ 2 ימים לאחר ההטבעה בהרכבה בינונית לכן, מומלץ. טיפול מיוחד צריך להילקח לא לסחוט את הרקמה בעת חיפוש מישור המוקד הנכון, שכן הוא עלול לגרום נזק חמור להכנה. בשל הקרינה מחוץ לפוקוס, חקירה נוספת עם מיקרוסקופיה confocal מומלצת.

תוצאות

אפיתל ריח en הכנות פנים יכול לשמש כדי לחקור לוקליזציה של חלבונים בcilia של תאי עצב תחושתיים, המאפשר חקירה מפורטת של חלבוני הלוקליזציה אינה ברורה לאחר ניתוח cryosections. בעיה זו יכולה להיות שהודגמה במקרה של ההכתמה לKin של חלבון כמו IRRE-2 (Kirrel2). Kirrel2 (המכונה גם Neph3) הוא חבר ?...

Discussion

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood