Todo el montaje de etiquetado de los cilios en el sistema olfativo principal de ratones

Resumen

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Resumen

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Introducción

El epitelio olfatorio del ratón en la cavidad nasal comprende 6-10000000 bipolares neuronas sensoriales olfativas ^1. Cada neurona olfativa elige una de 1.200 genes de receptores odoríferos para la expresión. Detección de los odorantes comienza por la unión a un receptor olfativo ^2, que entonces activa la adenilato ciclasa de tipo III (ACIII) ³ a través de la proteína G específica olfativa Ga _olf ⁴ odorante. El consiguiente aumento de la adenosina monofosfato cíclico (cAMP) abre un nucleótido cíclico-cerrada (GNC), canal catiónico no selectivo que conduce a afluencia de Ca ²⁺ y Na ^+, y, posteriormente, Ca ^{2 +} afluencia conduce a la apertura de un Cl Ca ²⁺ activado ^- canal de ^5,6. El resultante hacia afuera Cl ^- flujo es facilitado por un alto Cl intracelular ^- concentración constante mantenida por Cl ^- absorción, probablemente a través de la Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^- NKCC1 cotransportador, laCl ^- / HCO 3 ^- SLC4A1 intercambiador, y tal vez los transportistas adicionales aún por identificar ^6-8.

Neuronas olfativas bipolares tienen axones individuales, no ramificados que se proyectan directamente al bulbo olfatorio, y una dendrita que se extiende a la superficie del epitelio y termina como un compartimento especializado, el mando dendríticas. De este mando, 10-30 cilios, que puede alcanzar una longitud de hasta 50-60 micras, emanar en el moco que cubre la superficie epitelial ^9. Las proteínas de la cascada de transducción de señal canónica se localizan principalmente en la membrana de estas cilios. El aumento de la superficie del epitelio sensorial amplifica la capacidad de detectar olores. Debido a la densidad de las neuronas sensoriales, cilios que se extiende desde las perillas dendríticas vecinos se entremezclan. Esta interrelación resultados en una mezcla aleatoria de los cilios de diferentes neuronas, que expresan diferentes tipos de receptores olfativos, en la superficie del epitelio. La detección y la célulaular asignación de las proteínas ciliares que sólo están presentes en un subconjunto de neuronas sensoriales tanto, es difícil en criosecciones. Además, la localización precisa de dichas proteínas a lo largo de los cilios es apenas posible, ya que cryosections son típicamente más delgada que la longitud media de los cilios.

Para permitir la investigación de ciliar localización de las proteínas de membrana hasta ahora no caracterizados en las neuronas olfativas, hemos optimizado una técnica de preparación de la cara en la que permite el análisis detallado de la localización de proteínas en los cilios. En pocas palabras, se sacrifica el ratón y la cabeza dividió cerca de la línea media. Los cornetes, nasal, y los huesos frontales se retiran para exponer el tabique. El tabique con la parte olfativa del epitelio de revestimiento se afloja mediante la reducción de todas las conexiones a la cavidad nasal. Después de poner el tabique en una placa de Petri llena con solución de Ringer, el epitelio se despega und transferido a un portaobjetos de vidrio recubierto. Tras una breve fixatpaso de iones, procedimientos inmunotinción se puede realizar si la manipulación es tan suave como sea posible para evitar el daño del tejido frágil. Se demuestra la resolución alcanzable mediante la comparación de la tinción de dos proteínas de membrana diferentes en cilios olfatorios en cryosections clásicos y en la preparación cara es descrito.

Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron manejados en la Charité o Clínica Universitaria de Jena de acuerdo con las leyes de Cuidado Animal alemanes evitando cualquier sufrimiento innecesario de los animales.

1. Soluciones Preparación y Disección del lugar de trabajo

1. Soluciones
   NOTA: Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar la disección del epitelio.
   1. Soluciones para el procedimiento de disección:
      1. Preparar la solución de Ringer (pH 7,4) con concentraciones de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2 mM CaCl _2, 1 mM de MgCl _2, y glucosa 10 mM.
      2. Preparar una PBS ^{- / -} solución (pH 7,4) con concentraciones de 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH ₂ PO _4, NaCl 136 mM, y 8,1 mM Na ₂ HPO _4.
      3. Preparar una solución de fijación (pH 7,2) con concentraciones de 1x PBS ^{- / -,} 0,2 mM CaCl _2, 4% de sacarosa, y 4% de paraformaldehído. La sacarosa en la solución de fijación mejora crioseccionamiento y recoger de cryosections. Almacenar a -20 ° C.
   2. Soluciones para el procedimiento de tinción
      1. Preparar un PBS ^{+ / +} solución con concentraciones de 1x PBS ^{- / -,} 0,48 mM _MgCl2, 0,9 mM _CaCl2.
      2. Preparar una PBST ^{+ / +} solución con concentraciones de 1x PBS ^{+ / +} y 0,1% de Triton X-100.
      3. Preparar una solución de bloqueo con concentraciones de 1x PBST ^{+ / +} y 1% de gelatina.
2. Lugar de trabajo
   1. Para el lugar de trabajo de disección, usar un microscopio de disección con una iluminación brillante, así como una pluma líquido-bloqueante.
   2. Preparar una placa de Petri, lleno de solución de Ringer, y portaobjetos de vidrio adhesivas.
   3. Obtenga los siguientes instrumentos quirúrgicos: un par de tijeras quirúrgicas con un sostenido y una punta roma, un par de tijeras de primavera con forma de punta recta, dos pinzas con forma de punta curva fina y una hoja de afeitar ( Figura 1A).

2. Preparación del tabique nasal

1. Casa animales en jaulas aprobados con acceso regular a alimentos y agua y el ciclo día / noche apropiada.
2. Realizar la anestesia en un recipiente que contiene una gasa empapada cerrado con 100% de isoflurano y el monitor analgesia probando los reflejos del pie trasero. Desde dislocación cervical puede causar que la sangre en las cavidades nasales, decapitar directamente ratones anestesiados.
3. Quitar la piel para exponer el hueso de todo el cráneo y la nariz, y limpiar la sangre y el tejido restante a fondo usando una toalla de papel. Retire la mandíbula inferior y los dientes delanteros.
4. Incisión en la médula dorsal de la nariz bilateralmente en 1-2 mm de distancia paralela a la línea de sutura para separar un lado del tabique (medial) de la maxilar (lateralmente). Dividir la nariz con un solo corte. Si los restos de hueso y cornetes todavía están unidos al tabique, eliminar estas cuidadosamente para exponer el tabique completamentesin tocarlo.
5. Quitar el hueso nasal dorsal deslizando la punta curvada multa de una pinza a lo largo de la cara dorsal del tabique, entre el septo y el hueso nasal. Aplique una ligera presión sobre el hueso, empuje hacia arriba y retírela.
6. Para proporcionar acceso a los dos tejidos septales, uno de cada cavidad, retirar cuidadosamente el maxilar superior del otro lado de la cabeza. En la preparación de los animales más viejos (P> 28), retire la punta del hueso frontal que cubre los bulbos olfatorios.
7. Identificar el epitelio olfativo por su color ligeramente amarillo (Figura 1B). El epitelio respiratorio bordeando es blanco y muestra el movimiento de los cilios móviles que puede ser vista bajo el microscopio de disección. Corte a lo largo de la frontera entre el epitelio olfativo y respiratoria con un par de tijeras finas primavera.
8. Extienda el corte y separar el tabique de la conexión ventral al hueso vómer. A continuación, corte a lo largo de la frontera entre el tabique y la lámina cribosa del etmoides Ose. El tabique está completamente aislado de todas las conexiones a la cabeza. Use las posiciones de corte mostradas en la Figura 1C.

3. El aislamiento del epitelio olfativo para Inmunoticción

1. Publicar un portaobjetos de vidrio adhesivo en la placa de Petri llena con solución de Ringer. Colocarlo sobre el borde de la placa de Petri, de manera que una mitad del vidrio se encuentra en solución de Ringer (Figura 1A).
2. Utilice unas pinzas para transferir cuidadosamente el hueso etmoidal con el epitelio olfativo a la placa de Petri. Levante sin agarrarlo con las puntas de las pinzas.
3. Coge la placa perpendicular del hueso etmoides con uno fórceps y utilizar un segundo uno para quitar cuidadosamente el epitelio de un lado del tabique. Deslice la punta curvada entre la lámina perpendicular y el epitelio de pelar el epitelio apagado.
4. Sé siempre asegúrese de identificar el lado ciliar, en caso de que el epitelio voltea en soluti de Ringeren. Si el epitelio voltea, no es posible identificar el lado ciliar después. Sobre todo, el epitelio se enrolla con la superficie ciliar dentro.
5. Comparar la forma de tejido inscrito con las posiciones de corte mostrado en la Figura 1C. Coge el epitelio en una posición en la frontera y tire de ella en el portaobjetos de vidrio. No toque el lado ciliar con las pinzas para evitar lesiones del tejido.
6. Girar el septum y repetir el procedimiento con el epitelio desde el otro lado.
7. Seque el portaobjetos de vidrio alrededor de las dos piezas de epitelio olfativo con una toalla de papel y rodear el tejido con un lápiz líquido bloqueador.
8. Fijar el tejido con la solución de fijación 150 l durante 10 min a RT. En cuanto a la estabilidad y la integridad de los cilios, usar tiempos de fijación cortos para una variedad de anticuerpos ensayados. Dentro de estos 10 min cilios son fijos, pero probablemente no todo el tejido epitelial. Por lo tanto, visualizar inmediata con el microscopio después de los scontienen procedimiento. Sin embargo, los tiempos pueden variar para la adherencia de anticuerpos individuales.

4. Protocolo de tinción

NOTA: Maneje el tejido con mucho cuidado para preservar las estructuras ciliares de las neuronas sensoriales olfativas. Retire soluciones con la pipeta. No deje caer alguna solución directamente sobre el epitelio, como las fuerzas mecánicas podrían interrumpir la multa cilios. Realice todos los pasos a temperatura ambiente si no se indica lo contrario.

1. Eliminar la solución de fijador y lavar 2 veces con PBS ^{+ / +.}
2. Incubar el epitelio durante al menos 1 hora con solución de bloqueo.
3. Preparar la solución de anticuerpo primario mediante la disolución del anticuerpo en solución de bloqueo (1: 200 para los anticuerpos utilizados en este estudio) y centrifugar durante 5 min a velocidad máxima para eliminar cualquier precipitado.
4. Incubar el epitelio con una solución de anticuerpo en una cámara húmeda a 4 ° CO / N.
5. Epitelio lavado con PBS ^{+ / +} durante 5 minutos al menos 3 veces.
6. Preparar la solución de anticuerpo secundario disolviendo el anticuerpo en solución de bloqueo (1: 500) y centrifugar durante 5 min a toda velocidad.
7. Incubar el epitelio con una solución de anticuerpo secundario durante 1 hr en una cámara oscura.
8. Epitelio lavado con PBS ^{+ / +} durante 5 minutos al menos 3 veces.
9. Retire el líquido bloqueador con una hoja de afeitar o una toalla de papel. Lave el epitelio con agua destilada durante 5 s.
10. Preservar el tejido en antifade reactivo montaje.
    NOTA: La fluorescencia de fondo se incrementa rápidamente en cuestión de días; Por lo tanto, se recomienda el análisis microscópico, a más de 2 días después de la incorporación en medio de montaje. Especial cuidado se debe tener de no apretar el tejido cuando se busca el plano focal correcta, ya que puede dañar seriamente la preparación. Debido a la fluorescencia fuera de foco, se recomienda investigación adicional con microscopía confocal.

Resultados

Epitelio olfatorio en los preparativos de la cara puede ser utilizado para investigar la localización de las proteínas en los cilios de las neuronas sensoriales, lo que permite la investigación detallada de las proteínas cuya localización está claro después de un análisis de cryosections. Este problema puede ser ejemplificado en el caso de la tinción de la proteína para Kin-IRRE como 2 (Kirrel2). Kirrel2 (también llamado Neph3) es un miembro de la superfamilia de proteínas y funciones de la...

Discusión

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood