Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Özet

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Özet

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Giriş

burun boşluğunda koku epiteli fare 6-10.000.000 bipolar koku duyu nöronları ¹ içerir. Her koku nöron ifade 1.200 koku reseptör gen birini seçer. Koku tespiti daha sonra ⁴ _olf koku spesifik G protein Gα üzerinden adenilat siklaz tip III (ACIII) ³ aktive bir koku reseptörü ^2, bağlanma odorant başlar. siklik adenozin monofosfat (cAMP) 'de elde edilen artış açan bir nükleotid kapılı seçici olmayan katyon kanalı ^{Ca2 +} ve Na ^+, ve daha sonra, Ca girişine yol, (CNG) ^{2 +} akışı, bir Ca ^{+ 2} aktif Cl açılmasına neden olan siklik ^- Kanal ^5,6. dışarı doğru Cı Elde ^- akışı, yüksek hücre içi Cl kolaylaştırılır ^-, Na ⁺ / K ⁺ / Cl ile olası emme ^{-, -} ortak taşıyıcı NKCC1, konsantrasyon sabit Cl muhafazaCI ^- / HCO3 ^- değiştirici SLC4A1 ve belki ek henüz tespit edilmesi taşıyıcıları ^6-8.

Bipolar koku nöronlar tek dalsız koku ampul doğrudan proje akson ve epitel yüzeyine uzanan ve özel bölmesi, dendritik topuzu gibi biten bir dendrit vardır. Kadar um 50-60 kadar bir uzunluğa ulaşabilir, bu topuz, 10-30 kirpikler itibaren, epitel yüzeyi ⁹ kaplayan mukus içine sızmak. Kanonik sinyal iletimi akışının Proteinler ağırlıklı bu kirpikler zarında lokalize edilmektedir. epitel artan duyusal yüzey Koku moleküllerini tespit etme yeteneğine güçlendirir. Nedeniyle duyusal nöronların yoğunluğunun, komşu dendritik kolları uzanan kirpikler içe. Epitelyumunun yüzeyi üzerine, koku reseptörlerinin farklı ifade eden farklı nöron gelen kirpikler rastgele karışımı içinde bu karışmasının sonucu. algılama ve hücreduyusal nöronların bir alt kümesi, sadece mevcut siliyer proteinlerin nitlerin ayırma cryosections de zordur. Halinde kriyoseksiyonlar kirpikler ortalama uzunluğundan daha tipik olarak daha ince olduğu için ek olarak, kirpikler boyunca bu proteinlerin kesin yeri, hemen hemen mümkün değildir.

Koku nöronlarda kadar uncharacterized membran proteinlerinin siliyer lokalizasyonu soruşturma etkinleştirmek için, biz kirpikler protein lokalizasyonu detaylı analizini sağlayan bir tr yüz hazırlama tekniklerini optimize. Kısaca, fare kurban ve baş orta hatta yakın bölünür. Kıkırdakçıklar burun ve frontal kemik septum maruz bırakmak için çıkarılır. astar epitel koku kısmı ile septum burun boşluğuna tüm bağlantıları keserek gevşetilir. Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına septum konulduktan sonra, epitel kaplanmış bir cam slayt aktarılır und soyulur. Kısa bir fixat ardındantaşıma kırılgan doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca nazik ise iyon adım, immün işlemleri yapılabilir. Biz klasik cryosections ve tarif tr yüz hazırlık koku kirpikler iki farklı membran proteinlerinin boyama karşılaştırarak elde çözünürlük göstermektedir.

Protokol

NOT: Tüm hayvan prosedürleri hayvanların herhangi bir gereksiz acı kaçınarak Alman Hayvan Bakım yasalarına uygun olarak Charité veya Üniversite Kliniği Jena ele alındı.

1. hazırlanması Çözümler ve Diseksiyon İşyeri

1. Çözümler
   NOT: epitel diseksiyonu başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. Diseksiyon işlemi için Çözümler:
      1. 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM _CaCI2, 1 mM _MgCI2 ve 10 mM glukoz konsantrasyonları ile Ringer çözeltisi (pH 7.4) içinde hazırlayın.
      2. ^{- / -} 2.68 mM KCI, 1.47 mM KH ₂ PO _4, 136 mM NaCI, 8.1 mM _Na-2 HPO ₄ konsantrasyonlar çözeltisi (pH 7.4) içinde bir PBS hazırlayın.
      3. ^{- / -,} 0.2 mM _CaCI2,% 4 sukroz ve% 4 paraformaldehid 1x PBS konsantrasyonları ile bir tespit çözeltisi (pH 7.2) ile hazırlayın. Sabitleştirici çözelti içinde sukroz kriyo artırırkesit ve pick-up cryosections arasında. -20 ° C'de saklayın.
   2. Boyama işlemi için çözümler
      1. 1x PBS konsantrasyonları ile PBS ^{+ / +} çözeltisi hazırlayın ^{- / -,} 0.48 mM _MgCl2, 0.9 mM _CaCl2.
      2. 1x PBS ^{+ / +} ve% 0.1 Triton X-100 konsantrasyonları ile, PBST ^{+ / +} çözelti hazırlayın.
      3. 1x PBST ile ^{+ / +} ve% 1 jelatin konsantrasyonları ile bir blokaj çözeltisi hazırlayın.
2. Işyeri
   1. Diseksiyon işyeri için, parlak aydınlatma ile bir diseksiyon mikroskobu, yanı sıra sıvı-bloker kalem kullanın.
   2. Ringer çözeltisi, ve yapışkan cam lamlar ile doldurulmuş bir petri kabı, hazırlanır.
   3. Aşağıdaki cerrahi aletler elde: cerrahi makas keskin ve bir künt ucu, düz uç şekli ile yaylı makas, ince kavisli ucu şekli ve bir jilet ile iki forseps bir çift (olan Şekil 1A).

Burun Septumu 2. Hazırlık

1. Gıda ve su ve uygun gündüz / gece döngüsü düzenli erişimi onaylı kafeslerde ev hayvanları.
2. Arka ayak refleksleri test ederek% 100 izofluran ve monitör analjezi ile ıslatılmış bir kapalı hazne içeren gazlı bez anestezi gerçekleştirin. Servikal dislokasyon burun boşlukları kan neden olabildiğinden, doğrudan anestezi uygulanmış farelerin başını kesmek.
3. Tüm kafatası ve burun kemiği açığa çıkarmak için deri kaldırmak ve iyice bir kağıt havlu kullanarak kalan kan ve doku silin. Alt çene ve ön dişleri çıkarın.
4. Maksilla (yanal) den septum (medial) bir tarafını ayırmak için sütür hattına 1-2 mm mesafe paralel bilateral burun dorsal kemik İnsizyon. Tek bir kesim ile burun bölün. Kemik kalıntıları ve konka hala septum takılı ise, dikkatlice çıkarın tamamen septum maruzdokunmadan.
5. Septum ve burun kemiği arasında, septum dorsal kenarı boyunca bir forseps ince kavisli ucu kaydırarak dorsal nazal kemiği çıkarın. , Kemik üzerinde hafif basınç uygulayın yukarı itin ve çıkarın.
6. Her bir oyuğun iki septum dokulara erişime bir sağlamak için dikkatli bir şekilde baş diğer tarafında maksilla çıkarın. Büyük hayvanlar (> 28 P) hazırlanırken, koku ampuller kapsayan frontal kemik ucu çıkarın.
7. Onun hafif sarı renk (Şekil 1B) tarafından koku epiteli belirleyin. sınırındaki solunum epiteli beyaz ve mikroskop altında görülebilir hareketli kirpikler hareketini gösterir. İnce bahar makasla ile koku ve solunum epiteli arasındaki sınır boyunca kesin.
8. Kesim uzatın ve vomer kemik ventral bağlantıdan septum ayırın. Sonra septum ve Os etmoidit lamina cribrosa arasındaki sınır boyunca kesilmişör. septum artık tamamen kafasına bütün bağlantıları izole edilir. Şekil 1C gösterilen kesme konumlarını kullanın.

Immün için Koku Epitelinin 3. İzolasyonu

1. Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir petri yapışkan bir cam slayt yerleştirin. Camın bir yarım Ringer çözeltisi (Şekil 1A) 'de yer alan şekilde, bir petri kenarına yerleştirin.
2. Dikkatle petri koku epiteli ile etmoid kemik aktarmak için bir forseps kullanın. Forseps ipuçları ile kapma olmadan kaldırın.
3. Bir forseps ile etmoid kemiğin dik plaka tut ve dikkatli septum bir taraftan epitel kaldırmak için ikinci bir birini kullanın. Epitel kalkmasına dik plaka ve epiteli arasındaki kavisli ucu kaydırın.
4. Epitel Ringer soluti çevirir durumunda, siliyer tarafını belirlemek her zaman emin olunüzerine. Epitel çevirir ise, sonradan siliyer tarafı belirlemek pek mümkün değildir. Çoğunlukla, epitel içindeki silier yüzeyi ile rulo.
5. Şekil 1C gösterilen kesme pozisyonları ile kayıtlı doku şeklini karşılaştırın. Sınırda bir pozisyonda epitel tut ve cam slayt üzerine çekin. Doku lezyonları önlemek için forseps ile siliyer tarafına dokunmayın.
6. Septum çevirin ve diğer taraftan epitel ile işlemi tekrarlayın.
7. Bir kağıt havlu ile koku epiteli iki adet etrafında cam slayt kurulayın ve bir sıvı-bloker kalemle doku çevreler.
8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 ul sabitleyici çözeltisi ile doku sabitleyin. Kirpikler stabilite ve bütünlüğü ile ilgili olarak, test edilen antikorların çeşitli kısa sabitleme kez kullanmak. Bu 10 dakika kirpikler içinde sabit, ama muhtemelen bütün epitel dokusu vardır. Bu durumda, hemen s sonra mikroskop ile görselprosedürü yükümlüsünüzdür. Ancak, sabitleyici katı bireysel antikorlar için değişiklik gösterebilir.

4. Boyama Protokolü

NOT: koku alma duyu nöronlarının siliyer yapıları korumak için çok dikkatli doku tutun. Pipetleme çözüm çıkarın. Mekanik kuvvetler ince kirpikler bozabilir gibi, epiteli üzerine doğrudan herhangi bir çözüm düşürmeyin. Başka türlü belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında bütün adımları.

1. Sabitleştirici çözüm çıkarın ve PBS ^{+ / +} 2 kez yıkayın.
2. Bloke etme çözeltisi ile en az 1 saat süre ile epitel inkübe edin.
3. Herhangi bir çökelti kaldırmak için tam hızda 5 dakika boyunca (bu çalışmada kullanılan antikorlar için 200 1) ve santrifüj çözeltisi bloke antikor eritilmesi ile primer antikor çözeltisi hazırlayın.
4. 4 ° CO / K bir nemli oda içinde antikor çözeltisi ile epitel inkübe edin.
5. PBS ^{+ / +} için 5 dakika ile yıkayın epitel en az 3 kez.
6. Tam hızda 5 dakika boyunca ve santrifüj: çözeltisi (1: 500) bloke antikor eritilmesi ile ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
7. Bir karanlık oda içinde 1 saat süre ile ikinci antikor çözeltisi ile epitel inkübe edin.
8. PBS ^{+ / +} için 5 dakika ile yıkayın epitel en az 3 kez.
9. Bir jilet veya kağıt havlu ile sıvı-bloker çıkarın. 5 saniye süreyle damıtılmış su ile epitel yıkayın.
10. Antifade montaj reaktif doku korur.
    NOT: gün içinde hızlı bir şekilde arka plan flüoresan artar; en geç 2 gün içerisinde montaj ortamda gömme sonra mikroskobik analiz nedenle tavsiye edilir. Özel bakım Doğru odak düzlemi ararken ciddi hazırlık zarar verebilir, çünkü doku sıkmak için değil alınmalıdır. Nedeniyle out-of-odak floresan, konfokal mikroskobu ile daha fazla incelenmesi tavsiye edilir.

Sonuçlar

Yüz hazırlıkları tr Koku epitel olan yerelleştirme cryosections analizinden sonra belirsizdir proteinlerin detaylı soruşturma izin, duyusal nöronların kirpikler proteinlerin yerelleştirme incelemek için kullanılabilir. Bu sorun, Irre benzeri protein 2 (Kirrel2) olarak Kin için boyama durumunda örnek olarak gösterilebilir. (Aynı zamanda Neph3 olarak da adlandırılır) Kirrel2 bir homofilik yapışma proteini olarak zar proteinleri ve fonksiyonların immünoglobulin (Ig) süper ailesinin...

Tartışmalar

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood