마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

요약

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

초록

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

서문

비강의 마우스 후각 상피 6-10000000 바이폴라 후각 감각 신경 ^(1)을 포함한다. 각각의 후각 신경 세포는 표현 1,200 후각 수용체 유전자 중 하나를 선택합니다. 냄새 물질의 검출은 ⁴ _OLF 후각 특정 G 단백질 Gα를 통해 아데 닐 레이트 사이 클라 유형 III (ACIII) ^3를 활성화 후각 수용체 ^2에 결합 부 취제에 의해 시작됩니다. 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP)의 상승의 결과가 열립니다 염기 - 게이트 비 선택적 양이온 채널은 ^칼슘과 나트륨 ^+, 이후 칼슘의 유입으로 이어지는, (CNG) ²⁺ 유입 ^칼슘 활성화 (CL)의 개방에 이르게주기 ^- 채널 ^{5, 6.} 외부 CL 결과 ^- 플럭스는 높은 세포 (CL)에 의해 촉진된다 ^- 나 ⁺ / K ⁺ / CL을 통해 가능성 흡수, ^{- -} 공동 수송 NKCC1, 농도는 정상 (CL)에 의해 유지CL ^- / HCO3 ^- 교환 SLC4A1, 그리고 아마도 추가로 아직 확인되는 수송 ^6-8.

바이폴라 후각 신경 세포는 하나의 분지 후각 망울에 직접 투사 축삭과 상피의 표면에 연장하고 전문 구획, 수지상 노브로 끝나는 수상 돌기가있다. 최대 μm의 50 ~ 60까지의 길이에 도달 할 수 있습니다이 노브, 10 ~ 30 섬모,에서, 상피면 ^(9)을 덮고있는 점액으로 발산. 표준 신호 전달 캐스케이드의 단백질은 주로 이러한 섬모의 막 지역화됩니다. 상피 세포의 증가 된 감각 표면 취기를 감지하는 능력을 증폭한다. 인해 감각 뉴런의 밀도, 인접 수지상 노브로부터 연장 섬모 섞이는. 상피 세포의 표면 상에, 후각 수용체를 발현하는 다른 유형의 다른 뉴런의 섬모의 임의의 혼합물이 섞여서 결과. 검출 및 세포감각 신경의 일부에만 존재하는 섬모 단백질의 울라 할당은 저온부에서 어렵다. 저온부는 섬모의 평균 길이보다 일반적으로 더 얇은 때문에 또한, 섬모 따라 단백질의 정확한 정위 간신히 가능하다.

후각 신경 세포에서 지금까지 규명하지 않은 막 단백질의 섬모 현지화의 조사를 가능하게하기 위해, 우리는 섬모의 단백질 현지화의 상세한 분석을 허용하는 페이싱 준비 기술을 최적화. 요약하면, 마우스들을 희생하고 헤드는 중앙선 근처에 분할된다. 비갑개, 코, 그리고 정면 뼈 격막을 노출 제거됩니다. 안감 상피의 후각 부분 격벽은 비강에 모든 연결을 절단하여 느슨하게된다. 링거액 가득 페트리 접시에 격막을 넣은 후, 상피 코팅 된 유리 슬라이드로 전송 싶게 벗겨. 짧은 fixat 다음취급 깨지기 조직의 손상을 피하기 위해 가능한 한 완만 한 경우, 이온 단계는, 면역 염색 절차를 행할 수있다. 우리는 고전 저온부 및 설명 페이싱 제제 후각 섬모 두 가지 막 단백질의 염색을 비교하여 해상도를 달성 보여준다.

프로토콜

참고 : 모든 동물의 절차는 동물의 부당한 고통을 피하는 독일어 동물 보호 법률에 맞게 샤리 테 대학 병원 예나에서 처리되었다.

1. 준비 솔루션 및 해부 직장

1. 솔루션
   참고 : 상피의 해부를 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비합니다.
   1. 해부 절차를위한 솔루션 :
      1. 140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 10 mM의 HEPES, 2 mM의 _CaCl2를, 1 ㎜의 MgCl _2, 10 mM의 포도당 농도의 링거액 (PH 7.4)을 준비한다.
      2. ^{- / -} 2.68 mM의 KCl을, 1.47 mM의 KH ₂ PO _4, 136 mM의 NaCl을, 8.1 mM의 나 ₂ HPO _4의 농도의 용액 (PH 7.4) PBS를 준비합니다.
      3. ^{- / -} 0.2 mM의 _CaCl2를, 4 % 수 크로스, 4 % 파라 포름 알데하이드 PBS 1X의 농도 정착액 용액 (PH 7.2)을 준비한다. 정착액 솔루션 자당 크라이을 향상단면 및 것은 픽업 저온부의를. -20 ° C에서 보관하십시오.
   2. 염색 절차를위한 솔루션
      1. 1X PBS의 농도 PBS ^{+ / +} 솔루션을 준비 ^{- / -,} 0.48 mM의의 MgCl _2, 0.9 mM의 염화칼슘 _2.
      2. 1X PBS ^{+ / +} 0.1 % 트리톤 X-100의 농도 PBST ^{+ / +} 솔루션을 준비합니다.
      3. 1X PBST ^{+ / +} 1 % 젤라틴의 농도 차단 솔루션을 준비합니다.
2. 직장
   1. 해부 직장를 들어, 밝은 조명과 해부 현미경뿐만 아니라 액체 차단제 펜을 사용합니다.
   2. 링거액, 접착제 유리 슬라이드 가득 페트리 접시를 준비합니다.
   3. 다음과 같은 수술 도구를 얻 수술 가위 날카로운 하나는 무딘 팁, 스트레이트 팁 모양 봄 가위, 미세 곡선 팁 모양과 면도날 두 집게 한 쌍의 (로 그림 1A).

비중격 2. 준비

1. 음식과 물과 적절한 주 / 야간주기에 정기적으로 액세스 할 수있는 승인 케이지 하우스 동물.
2. 후면 발 반사 신경을 테스트하여 100 % 이소 플루 란과 모니터 진통제로 적셔 닫힌 소켓 포함 거즈에 마취를 수행합니다. 자궁 경부 전위가 비강에 혈액을 일으킬 수 있기 때문에, 마취 된 쥐 목을 벨.
3. 전체 두개골과 코의 뼈를 노출 피부를 제거하고 철저하게 종이 타월을 사용하여 남아있는 혈액과 조직을 닦아. 아래턱과 앞니를 제거합니다.
4. 상악 (측 방향)에서 격벽 (내측)의 한 쪽을 분리하기 위해 봉합선 1 ~ 2 mm 거리에 평행 한 양측 코의 등을 절개 뼈. 하나의 컷으로 코를 분할합니다. 뼈의 잔해 비갑개가 여전히 격벽에 부착하는 경우,주의 깊게을 완전히 제거 격막을 노출을 터치하지 않고.
5. 격막과 코 뼈 사이에 격막의 등의 측면을 따라 집게의 미세 곡선 팁을 밀어 지느러미 코 뼈를 제거합니다. 뼈에 약간의 힘을 주어 그것을 밀어 제거합니다.
6. 각각의 공간에 두 중격 조직에 대한 액세스를 제공하기 위해 조심스럽게 머리의 다른 쪽의 턱뼈를 제거합니다. 오래된 동물 (> 28 P)를 준비 할 때, 후각 전구를 덮고 정면 뼈의 끝 부분을 제거합니다.
7. 그 약간 노란색 (그림 1B)에 의해 후각 상피를 식별합니다. 경계 호흡기 상피은 흰색과 해부 현미경으로 볼 수있는 운동성 섬모의 움직임을 보여줍니다. 미세 스프링 가위로 후각 및 호흡기 상피 세포 사이의 국경을 따라 잘라.
8. 상처를 확장 및 보습 뼈 뼈에 복부 연결에서 격막을 분리합니다. 그런 다음 격막과 OS가 벌집의 사상 판의 경계에 따라 절단전자. 격벽은 이제 완전히 머리에 모든 연결에서 격리됩니다. 도 1C에 도시 된 절단 위치를 사용한다.

면역 염색의 후각 상피의 3. 분리

1. 링거액 가득 배양 접시에 접착제 유리 슬라이드를 놓습니다. 유리의 절반은 링거액 (그림 1A)에 놓 이도록, 페트리 접시의 가장자리에 배치합니다.
2. 조심스럽게 페트리 접시에 후각 상피 사골 뼈를 전송하는 집게를 사용합니다. 포셉의 팁을 잡아없이 들어 올립니다.
3. 한 집게와 사골 뼈의 수직 판을 잡고 조심스럽게 격벽의 한쪽에서 상피를 제거하기 위해 두 번째를 사용합니다. 상피를 벗겨 수직 플레이트와 상피 세포 사이의 곡선 끝을 밀어 넣습니다.
4. 상피가 링거 soluti에 뒤집 경우, 섬모 측을 식별 할 항상 확인에. 상피가 뒤집 경우 나중에 모양체 측을 거의 식별 할 수있다. 대부분, 상피 세포 내부의 섬모 표면과 롤업.
5. 도 1C에 도시 된 절단 위치와 등록 된 조직 형상을 비교한다. 국경에서 위치에서 상피 세포를 잡고 유리 슬라이드에 당깁니다. 조직의 병변을 방지하기 위해 집게와 섬모면을 만지지 마십시오.
6. 격막의 전원을 켜고 다른 측면에서 상피 절차를 반복합니다.
7. 종이 타월 후각 상피의 두 조각 주위에 유리 슬라이드를 건조 및 액체 차단제 펜으로 조직을 둘러싸.
8. 실온에서 10 분 동안 150 ㎕의 정착 용액으로 조직을 수정합니다. 섬모의 안정성과 무결성에 관한 시험 항체의 다양한 짧은 고정 시간을 사용합니다. 이 10 분 섬모 내에서 고정 된, 그러나 아마 전체 상피 조직된다. 따라서, S는 즉시 후속 현미경으로 시각화절차 이닝. 그러나, 정착 시간은 개별 항체 다를 수 있습니다.

4. 염색 프로토콜

참고 : 후각 감각 신경 세포의 섬모 구조를 유지하기 위해 매우 조심스럽게 조직을 처리합니다. 피펫 팅 솔루션을 제거합니다. 기계적인 힘이 미세 섬모를 중단 할 수로, 상피 세포에 직접 솔루션을 떨어 뜨리지 마십시오. 달리 명시하지 않을 경우 실온에서 모든 단계를 수행합니다.

1. 정착액 솔루션을 제거하고 PBS ^{+ / +와} 함께하는 과정을 2 회 반복한다.
2. 차단 솔루션 적어도 1 시간 동안 상피 세포를 품어.
3. 어떤 침전물을 제거하기 위해 최고 속도로 5 분 (본 연구에 사용 된 항체 (200) 1) 원심 분리기 차단 솔루션에 항체를 용해하여 일차 항체 솔루션을 준비합니다.
4. 4 ° CO / N에 습기 챔버에서 항체 용액으로 상피 세포를 품어.
5. PBS ^{+ / +} 5 분간 씻을 상피 적어도 3 회.
6. 최고 속도에서 5 분 동안 원심 분리 : 용액 (500 1) 차단에 항체를 용해 차 항체 솔루션을 준비합니다.
7. 어두운 챔버에서 1 시간 동안 차 항체 용액으로 상피 세포를 품어.
8. PBS ^{+ / +} 5 분간 씻을 상피 적어도 3 회.
9. 면도날이나 종이 타월로 액체 차단제를 제거합니다. 5 초 동안 증류수로 상피 세포를 씻으십시오.
10. antifade 장착 시약의 조직을 보존합니다.
    주 : 일 이내에 신속하게 배경 형광 증가; 늦어도 2 일 이내에 설치 매체에 삽입 한 후 현미경 분석 따라서 좋습니다. 특별한주의가 올바른 초점면을 검색 할 때이 심각하게 준비를 손상시킬 수 있기 때문에, 조직을 짜내하지 않도록주의해야합니다. 때문에 초점이 맞지 형광에, 공 초점 현미경으로 추가 조사를하는 것이 좋습니다.

결과

얼굴 제제 EN 후각 상피 그 지역화 저온부 분석 후 불분명 단백질의 상세한 조사를 허용 감각 뉴런의 섬모 단백질의 위치 파악을 조사하는데 사용될 수있다. 이 문제는 IRRE 같은 단백질 2 (Kirrel2)의 킨에 대한 염색의 경우에 예시 할 수있다. (Neph3도 불림)는 Kirrel2 homophilic 접착 단백질로서 세포막 단백질의 기능과 면역 글로불린 (IG) 슈퍼 패밀리의 일원이다. 이것은 시스템 후각 축삭 - 유도에?...

토론

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood