Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

Riepilogo

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Abstract

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Introduzione

L'epitelio olfattivo mouse nella cavità nasale comprende 6-10.000.000 bipolari neuroni sensoriali olfattivi ^1. Ogni neurone olfattivo sceglie uno dei 1.200 geni recettore olfattivo per l'espressione. Rilevazione di odoranti inizia legandosi ad un recettore olfattivo ^2, che attiva ciclasi di tipo III (ACIII) ³ tramite l'olfatto specifica proteina G Gα _olf ⁴ odorizzante. L'aumento conseguente adenosina monofosfato ciclico (cAMP) apre una ciclica nucleotide-gated (CNG), canale cationico non selettivo che porta a afflusso di Ca ²⁺ e Na ^+, e successivamente Ca ²⁺ afflusso porta all'apertura di un Cl Ca ²⁺ attivato ^- Canale ^5,6. La risultante partenze Cl ^- flusso è facilitata da un elevato intracellulare Cl ^- concentrazione mantenuta costante Cl ^- captazione, probabilmente attraverso il Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^- cotransporter NKCC1, laCl ^- / HCO3 ^- scambiatore SLC4A1, e forse altri trasportatori ancora essere identificate ^6-8.

Neuroni olfattivi bipolari presentano singoli, assoni non ramificati che proiettano direttamente al bulbo olfattivo, e un dendrite che si estende alla superficie dell'epitelio e termina in un vano specializzata, la manopola dendritica. Da questa manopola, 10-30 cilia, che può raggiungere una lunghezza di fino a 50-60 micron, emanare nel muco che copre la superficie epiteliale ^9. Proteine ​​della canonica cascata di trasduzione del segnale sono localizzati prevalentemente nella membrana di questi cilia. La superficie sensoriale maggiore dell'epitelio amplifica la capacità di rilevare odoranti. A causa della densità di neuroni sensoriali, cilia estendentesi da manopole dendritiche vicini mescolano. Questa compenetrazione risultati in una miscela casuale di cilia da diversi neuroni, che esprimono diversi tipi di recettori olfattivi, sulla superficie dell'epitelio. La rilevazione e la cellaassegnazione lare di proteine ​​ciliari che sono presenti solo in un sottogruppo di neuroni sensoriali è quindi difficile in criosezioni. Inoltre, la localizzazione precisa di tali proteine ​​lungo la cilia è appena possibile, poiché criosezioni sono tipicamente più sottile rispetto alla lunghezza media delle ciglia.

Per attivare la ricerca di localizzazione ciliare di proteine ​​di membrana finora non caratterizzate in neuroni olfattivi, abbiamo ottimizzato una tecnica di preparazione volto en, che consente l'analisi dettagliata di localizzazione delle proteine ​​in cilia. In breve, il mouse è sacrificato e la testa spaccata in prossimità della linea mediana. Turbinati, nasali e ossa frontali vengono rimossi per esporre il setto. Il setto con la parte olfattiva dell'epitelio rivestimento viene allentata tagliando tutte le connessioni alla cavità nasale. Dopo aver messo il setto in una capsula di Petri riempita con la soluzione di Ringer, l'epitelio è staccata und trasferito ad un vetrino rivestito. A seguito di una breve fixation passo, le procedure di colorazione può essere eseguita se la gestione è più delicata possibile per evitare danni del tessuto fragile. Dimostriamo la risoluzione ottenibile confrontando la colorazione di due diverse proteine ​​di membrana in cilia olfattiva in criosezioni classici e nella preparazione en face descritto.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati trattati presso la Charité o Clinica Universitaria di Jena in accordo con le leggi per la cura degli animali tedesca evitando ogni sofferenza indebita di animali.

1. Preparazione Soluzioni e Dissection Workplace

1. Soluzioni
   NOTA: Preparare le seguenti soluzioni prima di dissezione dell'epitelio.
   1. Soluzioni per la procedura di dissezione:
      1. Preparare la soluzione di Ringer (pH 7,4) con concentrazioni di NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, e glucosio 10 mM.
      2. Preparare un PBS ^{- / -} Soluzione (pH 7.4) con concentrazioni di 2.68 mM KCl, 1.47 mM Na KH ₂ PO _4, 136 mM NaCl, e 8,1 mm ₂ HPO _4.
      3. Preparare una soluzione di fissativo (pH 7,2) con concentrazioni di 1x PBS ^{- / -,} 0.2 mM CaCl _2, 4% di saccarosio, e 4% paraformaldeide. Saccarosio nella soluzione fissativo migliora cryosezionamento e pick-up di criosezioni. Conservare a -20 ° C.
   2. Soluzioni per la procedura di colorazione
      1. Preparare un ^{+ / +} soluzione PBS con concentrazioni di 1x PBS ^{- / -,} 0.48 mM MgCl _2, 0.9 mM CaCl _2.
      2. Preparare una PBST ^{+ / +} soluzione con concentrazioni di PBS 1x ^{+ / +} e 0,1% Triton X-100.
      3. Preparare una soluzione di saturazione con concentrazioni di 1x PBST ^{+ / +} e 1% di gelatina.
2. Workplace
   1. Per il lavoro dissezione, utilizzare un microscopio da dissezione con illuminazione brillante, così come una penna liquida-bloccante.
   2. Preparare una capsula di Petri, riempito con soluzione di Ringer, e vetrini adesivi.
   3. Ottenere i seguenti strumenti chirurgici: un paio di forbici chirurgiche con una forte e una punta smussata, un paio di forbici a molla di forma punta dritto, due pinze di finissima perfetta forma ricurva e una lama di rasoio ( Figura 1A).

2. Preparazione del setto nasale

1. Animali domestici in gabbia approvati regolare accesso al cibo e all'acqua e appropriato ciclo giorno / notte.
2. Eseguire l'anestesia in un recipiente contenente una garza imbevuta chiuso con il 100% isoflurano e il monitor analgesia testando i riflessi del piede posteriore. Dal dislocazione cervicale può causare sangue nelle cavità nasali, decapitare direttamente topi anestetizzati.
3. Togliere la pelle per esporre l'osso dell'intero cranio e il naso, e spazzare via il sangue e tessuto rimanente accuratamente con un tovagliolo di carta. Rimuovere la mandibola e denti anteriori.
4. Incidere l'osso dorsale del naso bilateralmente in 1-2 mm distanza parallela alla linea di sutura per separare una parte del setto (medialmente) dal mascellare (lateralmente). Dividere il naso con un unico taglio. Se resti ossei e turbinati sono ancora attaccati al setto, rimuoverli con cura per esporre completamente il settosenza toccarlo.
5. Rimuovere la dorsale osso nasale facendo scorrere la punta ricurva multa di una pinza lungo il lato dorsale del setto, tra setto e osso nasale. Applicare una leggera pressione sull'osso, spingere verso l'alto e rimuoverlo.
6. Per fornire l'accesso ai due tessuti settali, uno da ciascuna cavità, rimuovere accuratamente mascella dell'altro lato della testa. Quando si prepara animali più vecchi (P> 28), rimuovere la punta dell'osso frontale che copre i bulbi olfattivi.
7. Identificare l'epitelio olfattivo dal suo colore leggermente giallo (Figura 1B). L'epitelio respiratorio confinante è bianca e mostra il movimento delle ciglia mobili che può essere visto sotto il microscopio da dissezione. Tagliare lungo il confine tra epitelio olfattivo e respiratorio, con un paio di forbici di primavera belle.
8. Estendere il taglio e separare il setto dalla connessione ventrale all'osso vomere. Poi tagliare lungo il confine tra il setto e la lamina cribrosa del ethmoidal Ose. Il setto è ora completamente isolato da tutti i collegamenti alla testa. Utilizzare le posizioni di taglio illustrati nella Figura 1C.

3. Isolamento del olfattivo Epithelium per Immunostaining

1. Inserire un vetrino adesivo nella capsula di Petri riempita con soluzione di Ringer. Posizionarlo sul bordo della capsula di Petri, in modo che la metà del vetro risiede nella soluzione di Ringer (Figura 1A).
2. Usare una pinza per trasferire accuratamente l'osso etmoide con l'epitelio olfattivo alla capsula di Petri. Sollevare senza afferrare con le punte pinze.
3. Afferrare la piastra perpendicolare dell'osso etmoide con una pinza e utilizzare un secondo per rimuovere con attenzione l'epitelio da un lato del setto. Far scorrere la punta ricurva tra la piastra perpendicolari e epitelio a sbucciare la epitelio off.
4. Assicurarsi sempre di identificare il lato ciliare, nel caso in cui l'epitelio lanci in soluti del Ringeron. Se l'epitelio ribalta, è difficilmente possibile identificare il lato ciliare seguito. Per lo più, l'epitelio arrotola con la superficie interna ciliare.
5. Confrontare la forma del tessuto iscritti con le posizioni di taglio illustrati nella Figura 1C. Prendete l'epitelio in una posizione al confine e tirarlo sul vetrino. Non toccare il lato ciliare con le pinze per evitare lesioni del tessuto.
6. Spegnere il setto e ripetere la procedura con l'epitelio dall'altro lato.
7. Asciugare il vetrino attorno entrambi i pezzi di epitelio olfattivo con un tovagliolo di carta e circondare il tessuto con una penna liquido-bloccante.
8. Fissare il tessuto con 150 microlitri soluzione fissativa per 10 min a RT. Per quanto riguarda la stabilità e l'integrità cilia, utilizzare tempi di fissazione brevi per una varietà di anticorpi testati. All'interno di questi 10 min cilia sono fissi, ma probabilmente non l'intero tessuto epiteliale. Così, immediata visualizzare con microscopio successivamente alle scontenenti procedura. Tuttavia, i tempi possono variare fissativo per gli anticorpi individuali.

4. Protocollo di colorazione

NOTA: Maneggiare il tessuto con molta attenzione per preservare le strutture ciliari dei neuroni sensoriali olfattivi. Rimuovere soluzioni pipettando. Non far cadere alcuna soluzione direttamente sul epitelio, come forze meccaniche potrebbero comprometterne il bene cilia. Eseguire tutti i passi a RT, se non diversamente indicato.

1. Rimuovere la soluzione di fissativo e lavare 2 volte con PBS ^{+ / +.}
2. Incubare l'epitelio per almeno 1 ora con soluzione bloccante.
3. Preparare la soluzione anticorpo primario sciogliendo l'anticorpo in soluzione bloccante (1: 200 per gli anticorpi utilizzati in questo studio) e centrifugare per 5 min a piena velocità per rimuovere eventuali precipitati.
4. Incubare l'epitelio con soluzione di anticorpi in una camera umida a 4 ° CO / N.
5. Lavare epitelio con PBS ^{+ / +} per 5 minuti almeno 3 volte.
6. Preparare la soluzione di anticorpo secondario sciogliendo l'anticorpo in soluzione bloccante (1: 500) e centrifugare per 5 min a piena velocità.
7. Incubare l'epitelio con soluzione di anticorpo secondario per 1 ora in una camera oscura.
8. Lavare epitelio con PBS ^{+ / +} per 5 minuti almeno 3 volte.
9. Rimuovere il liquido-bloccante con una lametta o un tovagliolo di carta. Lavare l'epitelio con acqua distillata per 5 s.
10. Preservare il tessuto in antifade reattivo di montaggio.
    NOTA: aumenta rapidamente fluorescenza di fondo in pochi giorni; analisi microscopica non più tardi di due giorni dopo l'incorporazione in mezzo di montaggio è quindi consigliato. Particolare cura deve essere presa non stringere il tessuto durante la ricerca sul piano focale corretto, in quanto può danneggiare gravemente il preparato. A causa di fluorescenza out-of-focus, si raccomanda ulteriori indagini al microscopio confocale.

Risultati

Epitelio olfattivo en preparazioni faccia può essere usato per studiare la localizzazione delle proteine ​​nella cilia di neuroni sensoriali, consentendo l'indagine dettagliata di proteine ​​la cui localizzazione è chiaro dopo l'analisi di criosezioni. Questo problema può essere esemplificato nel caso della colorazione per Kin di proteine ​​IRRE-like 2 (Kirrel2). Kirrel2 (chiamato anche Neph3) è un membro della immunoglobuline (Ig) superfamiglia di proteine ​​di membrana e f...

Discussione

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood