Всего горе Маркировка ресничек в Главном обонятельной системе мышей

Резюме

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Аннотация

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Введение

Мышь обонятельный эпителий в полости носа состоит из 6-10 млн биполярных обонятельных сенсорных нейронов ^1. Каждый обонятельный нейрон выбирает один из 1200 одоранта рецепторных генов для экспрессии. Обнаружение пахучих веществ начинается с одоранта связывания обонятельного рецептора ^2, который затем активирует АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ типа III (ACIII) ³ с помощью обоняния специфического белка G Gα _олф ^4. В результате рост циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) открывает циклических нуклеотидов закрытого (CNG), неселективный катион канал, ведущий к притоку Ca ²⁺ и Na ^+, а впоследствии Ca ²⁺ приток приводит к открытию Са ²⁺ активированного Cl ^- канал ^5,6. Полученный наружу Cl ^- поток способствует высокой внутриклеточной Cl ^- концентрация поддерживается устойчивый Cl ^- поглощение, вероятно, через Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^- котранспортера NKCC1,Cl ^- / HCO 3 ^- теплообменник SLC4A1, и, возможно, дополнительные еще ​​не определены перевозчики ^6-8.

Биполярные обонятельные нейроны имеют одно-, неразветвленные аксоны, которые выступают непосредственно к обонятельной луковице, и дендриты, который проходит к поверхности эпителия и заканчивается в качестве специализированного отделения, дендритных ручки. С этой ручкой, 10-30 ресничек, которые могут достигать в длину до 50-60 мкм, исходят в слизи, покрывающей поверхности эпителия ^9. Белки канонической каскада трансдукции сигнала в основном локализованы в мембране этих ресничек. Увеличился сенсорная поверхность эпителия усиливает способность обнаруживать отдушки. Из-за плотности сенсорных нейронов, реснички, проходящую от соседних дендритных ручки смешиваются. Это смешение приводит к случайной смеси ресничек из различных нейронов, экспрессирующих различные типы обонятельные рецепторы, на поверхности эпителия. Выявление и клетокулар распределение цилиарных белков, которые присутствуют только в подгруппе сенсорных нейронов поэтому трудно в криосрезов. Кроме того, точная локализация таких белков вдоль ресничек едва возможно, поскольку, как правило, криосрезы тоньше, чем средняя длина ресничек.

Чтобы включить расследование мерцательного локализации до сих пор не охарактеризованных мембранных белков в обонятельных нейронов, мы оптимизировали собственная методика подготовки лица, которая позволяет детальный анализ локализации белка в ресничками. Вкратце, мышь умерщвляют и глава разделена рядом с линии. Раковин, носа и лобной кости удаляют, чтобы обнажить перегородки. Перегородки с обонятельной части футеровки эпителия ослаблен за счет сокращения всех соединений в полость носа. После ввода перегородки в чашку Петри, заполненную раствором Рингера, эпителий отслаивают унд передается на предметное стекло с нанесенным покрытием. После короткого fixatионная шаг, Иммуноокрашивание процедуры могут быть выполнены, если обращение является как можно более плавными, чтобы избежать повреждения хрупкого ткани. Мы демонстрируем достижимое разрешение путем сравнения окраски двух различных мембранных белков в обонятельной ресничек в классических криосрезов и в ванной подготовки лица описаны.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были обработаны в Шарите или университетской клинике Йены в соответствии с немецкими законами по уходу за животными, избегая каких-либо необоснованных страданий животных.

1. Подготовка решения и Препарирование на рабочем месте

1. Решения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте следующие решения до начала вскрытия эпителия.
   1. Решения для процедуры вскрытия:
      1. Подготовьте раствор Рингера (рН 7,4) с концентрацией 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, и 10 мМ глюкозы.
      2. Подготовка PBS ^{- / -} раствор (рН 7,4) с концентрацией 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH ₂ PO _4, 136 мМ NaCl, и 8,1 мМ Na ₂ HPO _4.
      3. Подготовьте фиксирующий раствор (рН 7,2) с концентрацией 1x PBS ^{- / -,} 0,2 мМ CaCl _2, 4% сахарозы, 4% параформальдегида. Сахарозы в закрепляющего раствора улучшает криосекционирования и пикап криосрезов. Хранить при -20 ° С.
   2. Решения для процедуры окрашивания
      1. Подготовьте PBS ^{+ / +} решение с концентрацией 1x PBS ^{- / -,} 0,48 мМ MgCl _2, 0,9 мМ CaCl _2.
      2. Подготовка PBST ^{+ / +} раствор с концентрацией 1X PBS ^{+ / +} и 0,1% Triton X-100.
      3. Подготовьте блокирующий раствор с концентрацией 1x PBST ^{+ / +} и 1% желатина.
2. Рабочее место
   1. Для вскрытия рабочем месте, использовать рассекает микроскоп с яркого освещения, а также в виде жидкости-блокатор ручку.
   2. Подготовка Петри, наполненную раствором Рингера и клеевых стеклах.
   3. Получить следующие хирургические инструменты: пару хирургических ножниц с одним острым и одним тупым кончиком, пара пружинных ножниц с прямыми форме иглы, два пинцета с тонкой изогнутой формы наконечника и лезвием бритвы ( 1А).

2. Подготовка носовой перегородки

1. Дом животные в утвержденных клетках с регулярным доступом к пище и воде и соответствующего цикла день / ночь.
2. Выполните анестезию в закрытый сосуд, содержащий марли, смоченной 100% изофлуран и монитора обезболивания путем тестирования задние рефлексы ног. Так смещения шейных позвонков может привести кровь в полости носа, непосредственно обезглавить наркотизированных мышей.
3. Снимите кожу, чтобы выставить кость всего черепа и носа, и вытереть оставшуюся кровь и ткани тщательно с использованием бумажным полотенцем. Снимите нижнюю челюсть и передние зубы.
4. Надрезать спинной кости носа с двух сторон в 1-2 мм Расстояние параллельно линии шва, чтобы отделить одну сторону перегородки (медиально) от верхней челюсти (в поперечном направлении). Сплит нос одного разреза. Если кости и остатки раковин все еще привязаны к перегородке, удалить их тщательно, чтобы разоблачить перегородку полностьюне касаясь его.
5. Удалить спинной носовой кости, сдвинув мелкий изогнутый кончик пинцетом вдоль спинной стороне перегородки между перегородкой и носовой кости. Применить небольшое давление на кости, нажмите на нее и извлеките его.
6. Чтобы обеспечить доступ к двум перегородки тканей, по одному от каждой полости, осторожно снимите верхнюю челюсть к другой стороне головы. При подготовке старых животных (Р> 28), снимите наконечник лобной кости, покрывающей обонятельных луковиц.
7. Определить обонятельный эпителий его слегка желтого цвета (рис 1б). Граничащих эпителия дыхательных путей белый и показывает движение подвижных ресничек, которые можно увидеть под микроскопом рассекает. Сокращение вдоль границы между обонятельной и эпителия дыхательных путей с парой тонких весенних ножницами.
8. Расширение вырезать и отделить перегородкой из брюшной подключения к сошника кости. Затем вырежьте вдоль границы между перегородкой и решетчатой ​​пластинки из решетчатого Osе. Перегородки в настоящее время полностью изолирован от всех подключений к голове. Используйте режущие позиции, показанные на рисунке 1С.

3. Изоляция обонятельного эпителия для Иммуноокрашивание

1. Поместите клейкую предметное стекло в чашку Петри, заполненную раствором Рингера. Поместите его на край чашки Петри, так что одна половина стакана состоит в раствор Рингера (фиг.1А).
2. Используйте пинцет, чтобы аккуратно поместите решетчатой ​​кости с обонятельного эпителия в чашке Петри. Поднимите его без захвата его пинцетом советы.
3. Возьмите перпендикулярной пластинкой решетчатой ​​кости с одним пинцетом и использовать второй осторожно удалите эпителия с одной стороны перегородки. Вставьте изогнутый кончик между перпендикулярной пластинкой и эпителия, чтобы очистить эпителий выключен.
4. Будьте всегда уверены, чтобы определить ресничек сторону, в случае эпителия сальто в Soluti Рингерана. Если эпителий сальто, вряд ли можно определить ресничек сторону впоследствии. Главным образом, эпителий закатывает с мерцательной поверхности внутри.
5. Сравните поступил форму ткани с режущими положениях, показанных на рис 1С. Возьмите эпителий в положении на границе и потяните ее на стекло. Не прикасайтесь к ресничек сторону пинцетом, чтобы избежать поражения ткани.
6. Поверните перегородку и повторите процедуру с эпителием с другой стороны.
7. Высушите стекле вокруг обеих частях обонятельного эпителия с бумажным полотенцем и окружить ткани с жидким блокатора пера.
8. Закрепить ткань с 150 мкл фиксирующего раствора в течение 10 мин при комнатной температуре. Что касается стабильности и целостности реснички, используйте короткие сроки фиксации для различных тестируемых антител. В течение этих 10 мин ресничек являются фиксированными, но, вероятно, не вся эпителий тканей. Таким образом, непосредственная визуализировать под микроскопом, следующего за Sсодержащие процедуры. Тем не менее, фиксирующие время может меняться для отдельных антител.

4. Протокол окрашивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ткани очень осторожно, чтобы сохранить ресничные структуры обонятельных сенсорных нейронов. Удалить решения с помощью пипетки. Не отбрасывайте растворы непосредственно на эпителий, как механические силы могут нарушить тонкую реснички. Выполните все шаги при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Снимите фиксирующий раствор и промыть 2 раза PBS ^{+ / +.}
2. Инкубируйте эпителий, по крайней мере, 1 часа с блокирующим раствором.
3. Получают раствор первичного антитела путем растворения антитела в блокирующем растворе (1: 200 для антител, использованных в данном исследовании) и центрифуги в течение 5 мин при полной скорости, чтобы удалить любые осадки.
4. Инкубируйте эпителия с раствором антител во влажной камере при 4 ° CO / N.
5. Промыть эпителия с PBS ^{+ / +} в течение 5 мин по меньшей мере, три раза.
6. Получают раствор вторичного антитела путем растворения антитела в блокирующем растворе (1: 500) и центрифуги в течение 5 мин при полной скорости.
7. Инкубируйте эпителия с вторичного раствора антител в течение 1 часа в темную камеру.
8. Промыть эпителия с PBS ^{+ / +} в течение 5 мин по меньшей мере, три раза.
9. Удалить жидкость-блокатор при помощи лезвия бритвы или бумажным полотенцем. Промыть эпителия с дистиллированной водой в течение 5 с.
10. Сохранение ткани в antifade монтажа реагента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: фоновой флуоресценции быстро возрастает в течение нескольких дней; Микроскопическое исследование не позднее, чем через 2 дня после встраивания в монтажную среду Поэтому рекомендуется. Особое внимание должно быть принято не выжать ткань при поиске правильного фокальной плоскости, так как это может привести к серьезному повреждению подготовки. Из-за вышедшего из фокуса флуоресценции, дальнейшее расследование с конфокальной микроскопии рекомендуется.

Результаты

Обонятельный эпителий фас препаратов может быть использован для исследования локализации белков в ресничками сенсорных нейронов, позволяя детальное исследование белков, локализация непонятно после анализа криосрезов. Эта проблема может быть проиллюстрировано в случае окрашив...

Обсуждение

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood