成长型测定和遗传需求生化确认的蛋白质降解<em&gt;酿酒酵母</em

摘要

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

摘要

调节蛋白的降解是几乎每一个细胞功能的关键。大部分所了解的分子机制和真核细胞的蛋白质降解基因的要求，最初成立于酿酒酵母 。蛋白质降解的经典分析都依赖于生化脉冲追踪和放线菌酮追方法。尽管这些技术提供了敏感装置，用于观察蛋白降解，它们是费力，费时，并且低通量。这些方法不适合于快速或大规模筛选突变防止蛋白质降解。这里，酵母生长为基础的检测为浅显鉴定为蛋白降解基因的要求进行说明。在该测定中，需要对特定的选择条件下生长记者酶融合到一种不稳定的蛋白。细胞缺乏内源性报告酶，但表达该融合蛋白可以在塞莱生长只有当融合蛋白被稳定莫如条件下（ 即 ，当蛋白质的降解受到损害）。在这里所描述的生长测定，野生型和突变体的酵母细胞携带的质粒编码的融合蛋白的系列稀释液点样到选择性和非选择性培养基。选择条件下的生长是由给定的突变降解减值一致。增加蛋白质丰度应生化证实。一种酵母蛋白在适合电泳和免疫印迹形式的快速提取方法也证实。甲生长基于读出的蛋白质稳定性，并以简单的协议，用于蛋白提取用于生化分析，有利于快速鉴定对蛋白降解的基因的需求。这些技术可以适用于监视各种短命的蛋白质的降解。在呈现的例子中，HIS3酶，这是需要组氨酸的生物合成，融合到Deg1 -Sec62。Deg1 -Sec62是针对退化后异常从事内质网位子。细胞窝藏Deg1 -Sec62-HIS3能够选择性条件下生长时，蛋白质被稳定化。

引言

选择性蛋白质降解是对真核生命至关重要，并且改变的蛋白质降解有助于若干医疗条件，其中包括几种类型的癌症，神经变性疾病，心血管疾病，和囊性纤维化^1-5。泛素-蛋白酶体系统（UPS），其催化选择性的蛋白质降解，是在这些条件^6-10一个新兴的治疗靶点。泛素连接酶共价连接的76个氨基酸的泛素蛋白质¹¹的聚合物。已标有泛素链蛋白识别并〜2.5 megadalton 26S蛋白酶体蛋白水解^12。已经在模型真核生物酿酒酵母 （芽殖酵母）发起的研究已经基本在真核细胞中的蛋白质降解机理的阐明。 UPS的首次展示的生理基板是酵母转录抑制^MATα213，UPS的14，和许多高度保守的成分被首次发现或特征酵母（ 如 ^15-26）。在这种多功能和基因听话的模式生物中发现的有可能继续提供重要见解泛素介导的降解机制保守。

识别大多数UPS基板和降解需要多种蛋白质的一致行动。因此，在表征一个给定的不稳定蛋白的调节的降解的一个重要目标是确定蛋白水解基因的需求。经典方法（ 例如脉冲追踪和放线菌酮追踪实验^27），用于监测蛋白降解在哺乳动物或酵母细胞是费力和耗时的。虽然这些类型的方法中，用于检测蛋白质的降解提供高度敏感的装置，它们不适合用于蛋白降解或大规模screeni快速分析纳克的突变，防止蛋白质的降解。这里，酵母生长为基础的检测的快速鉴定为不稳定的蛋白质的降解的遗传要求提出。

在酵母生长系的分析方法，蛋白降解，感兴趣（或降解信号）不稳定的蛋白质融合，在帧中，对所需要的特定环境下酵母生长的蛋白质。其结果是一种人工基质，可作为一种强大的工具，以确定所关注的不稳定蛋白的蛋白质降解的遗传要求。便利地，最常用的实验室酵母菌株怀有突变的基因编码涉及的特定氨基酸或含氮碱（ 例如 ^20,28-30）的生物合成的代谢酶的小组。这些酶可用于在不存在在其合成中的酶参与外源提供的代谢物的细胞增殖至关重要。这样因而代谢酶可充当生长基记者不稳定蛋白质的降解与它们稠合。对蛋白降解的基因的需求可以容易地阐明，因为突变阻止蛋白水解将允许细胞窝藏降解记者选择条件下生长。

生长优势是一个间接指示特定的突变增加目的蛋白质的丰度。然而，直接生化分析，以确认突变允许的增长，通过增加蛋白质的水平，而不是通过间接的或人为的原因。在蛋白丰度突变的作用可能是通过稳态蛋白水平的细胞和不怀有特定突变蛋白质印迹分析来确定。一种酵母蛋白的快速高效提取（酵母细胞用氢氧化钠和样品缓冲的顺序孵化）在适当的形式方法通过免疫印迹分析也提出了^31。总之，这些实验有助于快速识别蛋白质降解的候选人监管机构。

研究方案

1.酵母生长试验，以确定候选人突变体有缺陷的蛋白质降解

1. 变换的野生型和突变体的酵母细胞用质粒编码融合不稳定蛋白质，在帧中，记者代谢酶。
2. 接种在5ml合成的定义（SD）的基本培养基中是选择性的细胞窝藏质粒分子的转化体。孵育过夜，在30℃，旋转。
3. 测量在每个过夜培养物在600nm（OD _600）的光密度。
   注:按照过夜温育后，细胞在培养中可在任一对数或稳定生长期，但应已达到一个最小的OD ₆₀₀为0.2。非常缓慢生长的酵母菌株，可能需要的孵育时间长于一晚，或接种的更大数目的细胞，如根据经验确定。
4. 制备转化的酵母细胞的6倍连续稀释在无菌96孔板，与细胞稀释至开始ñOD ₆₀₀为0.2。将每个酵母转化体中，在96孔板不同行待测定。
   1. 对于每一个转化体，计算稀释细胞至0.2的OD ₆₀₀在200微升最终体积所需过夜培养物的体积。过夜培养这个体积添加到相应井柱1.添加无菌水适量使体积为200微升。
   2. 用于酵母中的每一行，在列2，3和4中添加125微升无菌水到孔中。
      注:独立包装的无菌96孔板可与无菌盖包装。盖子可以用作藏为分布在这个步骤中的无菌水。这允许无菌水同时传输到所有孔中一个给定列用多通道移液器。
   3. 通过上下吹打用多通道移液器混合的第一列（酵母稀释至OD ₆₀₀为0.2）的内容。
   4. TRANSF呃25微升酵母从第1列至第2列，采用了多通道移液器。通过上下吹打混匀。转移25微升从第2列到第3列，以及25微升从第3列到第4列（混合以及在每一个步骤）。
5. 混合用多通道移液器各样品。从最稀进行到至少稀酵母，吸管4微升各样品的柱到含有适当的选择培养基两个板。使用一个板中维持质粒的选择（这个板块作为酵母斑点和生长控制）。使用第二板介质，其选择用于融合到报道酶不稳定蛋白的质粒保持和表达。因为酵母沉降快速，通过上下抽吸混合细胞定期。
   注:干燥机板会更容易吸收液体比新制备的板，因此推荐用于这些实验。湿板可以通过在室温下孵育在LO被干燥瓦特湿度下1 - 2天或更短的孵育在层流罩。板可干不均匀，如果空气层流平行于板凳。使用模板可以更容易地发现酵母细胞在固定距离。两个样品模板在图1中提供的，这些可以被印刷，切出，并固定在培养皿盖的内侧。
6. 允许板晾干在板凳上面。
7. 孵育板在30℃下进行2 - 6天。
8. 拍摄培养后各板。

图1.模板为察觉酵母细胞到100毫米的琼脂平板上。这些模板可以用来促进在与多通道移液器规则距离斑点酵母。模板可以被打印，切出，并固定在培养皿盖的内侧。将培养皿中生长中内盖与模板贴。模板都标有一个缺口，以追踪定位。因此建议在生长测定中使用板可以同样标有一个缺口以跟踪方向。模板察觉四（A）或五个（B）提供了酵母细胞的连续稀释， 请点击这里查看这个数字与100毫米的模板的打印版本。

酵母生长试验2.生化确认

1. 酵母细胞和后碱性蛋白抽提增长（从³¹修改）
   1. 变换的野生型和突变体的酵母细胞用质粒编码不稳定的蛋白质。
   2. 在5毫升的SD培养基是选择性的细胞窝藏质粒分子的接种转化体。孵育过夜，在30℃，旋转。
   3. 测量每个隔夜立方米的OD ₆₀₀lture。
      注:培养过夜后，细胞可在任一对数或稳定生长期，但应已达到的OD _600，其将允许稀释至0.2在10毫升新鲜的选择性培养基（步骤2.1.4）的外径_600。非常缓慢生长的酵母菌株，可能需要的孵育时间长于一晚，或接种的更大数目的细胞，如根据经验确定。
   4. 稀释的酵母细胞，以0.2的10ml新鲜的选择性培养基的OD _600。
   5. 继续孵育细胞在30℃，旋转或摇动，直到培养物达到OD ₆₀₀ 0.8和1.2之间（ 即在中期对数生长）。
      注意:如果感兴趣的不稳定的蛋白质是一个可调节的启动子的控制下，诱导蛋白表达和细胞收获的最佳时机可以根据以往的研究或经验观察不一。
   6. 收集2.5 OD ₆₀₀单位文化在一个15毫升的锥形人管离心5000 xg离心5分钟，在室温下进行。吹打或抽吸去除上清液。
      注_:600单元被以1.0的OD ₆₀₀定义为酵母的存在量在1ml培养的一个外径。 V = 2.5的OD ₆₀₀单位/测量的OD _600:培养（以毫升）收获2.5的OD ₆₀₀单位（Ⅴ）所需的体积可以使用以下等式来确定
   7. 重悬的细胞在1ml蒸馏水中。转移的悬浮细胞至微量离心管。
   8. 通过离心沉淀细胞在6500×g离心30秒，在室温下进行。吹打或抽吸去除上清液。
   9. 重悬的细胞在100μl蒸馏水通过上下抽吸或涡旋，并加入100微升的0.2M NaOH中。通过上下吹打混匀。孵育样品5分钟，在室温下进行。
   10. 丸细胞（其中大部分尚未释放的蛋白质和仍然存活）离心18000×克5分钟。吹打或抽吸去除上清液。
   11. 重悬沉淀在50 - 100微升1×Laemmli样品缓冲液，将细胞裂解，通过上下吹打或涡旋。
       注意:使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液系统和免疫印迹在pH用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）兼容除去碱性上清液以下离心并将细胞在Laemmli样品缓冲液的后续再悬浮的提取物的蛋白质。
   12. 要充分使蛋白质变性，孵育裂解物在95℃下5分钟。
       注意:当在95℃下温育聚集倾向的蛋白（ 例如，蛋白的几个跨膜片段）可能成为不溶性的。因此，裂解物应在较低温度下孵育（ 例如 37℃ - 70℃）10 - 30分钟，因为经验确定，这样的蛋白质的分析。
   13. 凉爽裂解物通过放置在冰上5分钟。
   14. 离心裂解物在18000×g离心，在室温下1分钟以沉淀不溶物质。取上清液（溶解提取的蛋白质）通过SDS-PAGE之前，随后的免疫印迹分析（2.2节）分开。可替代地，存储裂解物在-20℃。
2. 代表西方的印迹协议
   1. 加载裂解物的经验确定的体积的SDS-PAGE凝胶。
   2. 运行凝胶在200V直到染料前沿到达凝胶的底部。
   3. 在4℃下90分钟 - 从凝胶到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜通过湿转印转移蛋白在20 V 60。
   4. 块膜孵育在5％脱脂乳的Tris缓冲盐水（TBS）中，摇摆，进行1小时，在室温下过夜或在4℃下。
   5. 倒出封闭溶液。
   6. 孵育膜用1％脱脂乳的TBS特异于感兴趣蛋白质一级抗体（或表位标签体）用0.1％吐温20（TBS / T）1小时，在室温德mperature，摇摆。
   7. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
   8. 孵育膜用适当的荧光团共轭的二级抗体在1％脱脂乳的TBS / T为1小时，在室温下，摇摆。
      注意:由于荧光团是光敏感，荧光团共轭抗体的稀释度应在黑暗中来制备。另外，在荧光团共轭抗体的存在膜的孵化应发生在遮光容器中。这可以通过包装孵育塔板在铝箔来完成。
   9. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
   10. 收购膜采用LI-COR奥德赛CLX和图像Studio软件（或类似的影像设备和软件）的图像，根据制造商的建议。
   11. 成像膜后，孵育该膜与特异于负载的第一抗体在室温下1小时，以1％脱脂牛奶的TBS / T控制时蛋白质，摇摆。
   12. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
   13. 孵育膜用适当的荧光团共轭的二级抗体在1％脱脂乳的TBS / T为1小时，在室温下，摇摆。
   14. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
   15. 收购膜采用LI-COR奥德赛CLX和图像Studio软件（或类似的影像设备和软件）的图像，根据制造商的建议。

结果

为了说明这种方法，在HIS3酶已被稠合到模型内质网（ER）相关退化的羧基末端（ERAD）基板，Deg1 -Sec62（ 图2A）来创建Deg1 -Sec62-HIS3（ 图3） 。Deg1 -Sec62代表在与位子持续，异常协会有针对性一类新的ERAD基板的创始成员之一，该通道主要负责跨ER膜^32-34动蛋白。此类不稳定蛋白已经暂时被称为ERAD-T（对于易位子相关）衬底。以往的研究表明，当异?...

讨论

这里介绍的方法允许快速测定和蛋白质降解酵母细胞中的遗传要求生物化学确认。这些实验中突出酵母的效用和权力作为一种模式真核生物（协议的处理，存储和操纵酵母细胞（ 如酵母^41-44生物学的几个优秀的审查和汇编），可用于调查新的生物体）。的技术可以很容易地被应用到调查的各种类的蛋白质的降解和丰富。例如，其他人已采用这种策略来表征不稳定胞质，细胞核和ER腔...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components			Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole	Fisher Scientific	AC264571000	Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)	Roche	11088726001	May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped	Sarstedt	82.1581.001	Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl	Gilson	F14401	Available from a variety of manufacturers
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl	Gilson	F14403	Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System)	Bio-Rad	170-8195	A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater	Fisher Scientific	1172011AQ	Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application