Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zusammenfassung

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Zusammenfassung

Geregelten Proteinabbau ist entscheidend für praktisch jede Zellfunktion. Vieles von dem, was über die molekularen Mechanismen und genetischen Erfordernisse für eukaryotische Proteinabbau bekannt wurde zunächst in Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Klassische Analysen der Proteinabbau haben biochemische Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Methoden verlassen. Während diese Techniken empfindliche Mittel zur Beobachtung des Proteinabbaus sind mühsam, zeitaufwendig und niedrigem Durchsatz. Diese Ansätze sind nicht geeignet, um eine schnelle und großflächige Screening auf Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay für die leichte Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau beschrieben. In diesem Test wird ein Reporterenzym für das Wachstum unter bestimmten Selektionsbedingungen erforderlich, um ein instabiles Protein fusioniert ist. Zellen, denen das endogene Reporter-Enzym exprimieren, aber das Fusionsprotein unter sele wachsenctive Bedingungen nur, wenn das Fusionsprotein stabilisiert ist (dh, wenn der Proteinabbau gefährdet ist). Bei dem hier beschriebenen Wachstumstest werden Verdünnungsreihen von Wildtyp und mutierten Hefezellen ein Plasmid ein Fusionsprotein kodiert, auf selektiven und nicht-selektiven Medium entdeckt. Wachstum unter selektiven Bedingungen entspricht Abbau Beeinträchtigung von einer bestimmten Mutation. Erhöhte Proteinmenge sollte biochemisch bestätigt werden. Ein Verfahren zur schnellen Extraktion von Hefe-Proteinen in einer für die Elektrophorese und Western-Blotting Form wird auch gezeigt. Ein Wachstum basierende Auslesen für die Proteinstabilität, kombiniert mit einer einfachen Protokoll für die Proteinextraktion zur biochemischen Analyse, erleichtert die schnelle Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau. Diese Techniken können angepaßt, um den Abbau einer Vielzahl von kurzlebigen Proteinen zu überwachen. In dem dargestellten Beispiel des HIS3-Enzym, das für die Biosynthese von Histidin erforderlich ist, fusioniertum deg1 -Sec62. deg1 -Sec62 ist für den Abbau gezielt nach der aberrant die Endoplasmatischen Retikulum Translokon einrastet. Zellen, die deg1 -Sec62-His3 konnten unter selektiven Bedingungen wachsen, wenn das Protein stabilisiert wurde.

Einleitung

Selektive Proteinabbau ist für eukaryontische Leben und veränderten Proteinabbau trägt zu einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich verschiedene Arten von Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislaufkrankheiten und Mukoviszidose ^1-5. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die selektive Proteinabbau katalysiert, ist eine aufstrebende therapeutisches Ziel für diesen Bedingungen ^10.6. Ubiquitin-Ligase kovalent an Polymere der 76-Aminosäure-Ubiquitin an Proteine ^​​11. Proteine, die mit Polyubiquitinketten markiert wurden, werden erkannt und durch die ~ 2,5 Megadalton 26S Proteasom proteolysiert ^12. Studien im Modell eukaryotischen Organismus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) initiiert wurden grund bei der Aufklärung von Proteinabbaumechanismen in eukaryotischen Zellen. Der erste Beweis physiologischen Substrat der USV war die Hefe Transkriptionsrepressor MATα2 ¹³, 14, und viele hoch konservierte Komponenten des UPS wurden zuerst identifiziert oder gekennzeichnet Hefe (zB ^15-26). Entdeckungen in diesem vielseitigen und genetisch manipulierbaren Modellorganismus hergestellt werden wahrscheinlich weiterhin wichtige Einblicke in konservierten Mechanismen des Ubiquitin-vermittelten Abbau liefern.

Anerkennung und Abbau der meisten UPS Substrate erfordern die konzertierte Aktion von mehreren Proteinen. Daher ist ein wichtiges Ziel bei der Charakterisierung des geregelten Abbau einer bestimmten instabilen Protein die genetischen Erfordernisse für die Proteolyse zu bestimmen. Klassische Ansätze (zB Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Experimente ²⁷⁾ zur Überwachung der Proteinabbau in Säugetier- oder Hefezellen sind mühsam und zeitaufwendig. Während diese Art von Methode bereitzustellen hochempfindliche Einrichtung zum Erfassen des Proteinabbaus für eine schnelle Analyse des Proteinabbaus oder Groß screeni sind sie nichtng für Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay zur schnellen Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Abbau von instabilen Proteinen präsentiert.

Im Hefewachstum basiertes Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau, ein instabiles Protein von Interesse (oder Abbausignals) fusioniert, im Rahmen, ein Protein, das für das Wachstum der Hefe unter bestimmten Umständen erforderlich ist. Das Ergebnis ist ein künstliches Substrat, das als ein mächtiges Werkzeug, um die genetischen Voraussetzungen des Proteinabbaus der instabilen Protein von Interesse festzustellen, dienen können. Zweckmßigerweise beherbergen am häufigsten verwendeten Labor Hefestämme eine Gruppe von Mutationen in Genen, die Stoffwechselenzyme in der Biosynthese von bestimmten Aminosäuren oder stickstoffhaltigen Basen (zB ^20,28-30) beteiligt kodiert. Diese Enzyme sind für die zelluläre Proliferation in Abwesenheit von exogen bereitgestellt Metaboliten in deren Synthese der Enzyme beteiligt. Sometabolische Enzyme können so als Wachstumsbasis Reporter für den Abbau von instabilen Proteinen, denen sie fusioniert sind. Die genetischen Voraussetzungen für den Proteinabbau kann leicht erklärt werden, da Mutationen, die Proteolyse zu verhindern, können Zellen, die das Abbau Reporter, unter selektiven Bedingungen wachsen.

Einen Wachstumsvorteil ist ein indirekter Hinweis auf eine bestimmte Mutation erhöht die Häufigkeit des Proteins von Interesse. Allerdings ist direkte biochemische Analyse erforderlich, um zu bestätigen, dass eine Mutation ermöglicht Wachstum durch erhöhte Protein-Ebene und nicht durch indirekte oder Artefakt Ursachen. Die Wirkung einer Mutation auf Proteinmenge kann durch Western-Blot-Analyse der Steady-State-Protein-Spiegel in den Zellen, und tun nicht die bestimmte Mutation beherbergen bestätigt werden. Ein Verfahren für die schnelle und effiziente Gewinnung von Hefeproteinen (sequentielle Inkubation der Hefezellen mit Natriumhydroxid und Probenpuffer) in einer geeigneten Formfür die Analyse durch Western-Blot wird ebenfalls vorgestellt ^31. Zusammen stellen diese Experimente ermöglichen die schnelle Identifizierung von Kandidatenregulatoren der Proteinabbau.

Protokoll

1. Hefe-Wachstumstest zur Kandidaten Mutanten Defekte in Proteinabbau identifizieren

1. Transformieren Wildtyp- und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid einen instabilen Protein fusioniert codiert, im Rahmen, mit einem Reporter-Stoffwechselenzym.
2. Beimpfen von Transformanten in 5 ml synthetischem definiert (SD) Minimalmedium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert.
3. Anschließend wird die optische Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ von jeder Übernachtkultur.
   HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen in Kultur in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein, sollte aber eine minimale OD ₆₀₀ von 0,2 erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt.
4. Bereiten sechsfache serielle Verdünnungen von transformierten Hefezellen in einem sterilen 96-Well-Platte, beginnend mit den Zellen, um eine verdünnten OD ₆₀₀ von 0,2. Platzieren jedes Hefetransformante in einer anderen Reihe in der Platte mit 96 Vertiefungen untersucht werden.
   1. Für jede Transformante, die Berechnung des Volumens der Übernacht-Kultur erforderlich ist, um Zellen zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 in einem Endvolumen von 200 ul verdünnt. Fügen Sie diese Volumen von Übernacht-Kultur, um die entsprechende Vertiefung in Spalte 1. Fügen Sie die entsprechende Menge an sterilem Wasser, um das Volumen auf 200 ul zu bringen.
   2. Für jede Reihe von Hefe, fügen 125 ul sterilem Wasser, um die Vertiefungen in den Spalten 2, 3 und 4.
      HINWEIS: Einzeln verpackte sterile 96-Well-Platten mit einer sterilen Deckeln verpackt werden. Der Deckel kann als Reservoir für das sterile Wasser, das in dieser Stufe verteilt werden. Dies ermöglicht die gleichzeitige Übertragung von sterilem Wasser zu allen Vertiefungen in einer bestimmten Spalte mit einer Mehrkanalpipette.
   3. Mischen Sie den Inhalt der ersten Spalte (Hefe zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 verdünnt) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mehrkanalpipette.
   4. Transfer 25 ul Hefe aus Spalte 1 bis Spalte 2, mit einer Mehrkanalpipette. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Transfer 25 ul aus Spalte 2 bis Spalte 3, und 25 ul aus Spalte 3 bis Spalte 4 (gut mischen bei jedem Schritt).
5. Mischen Sie jede Probe mit einer Mehrkanalpipette. Ausgehend von den meisten verdünnten in wenigstens verdünnte Spalten von Hefe, einer Pipette 4 ul jeder Probe auf beiden Platten, die den entsprechenden Selektionsmedium. Verwenden Sie eine Platte mit Medium, das Plasmid-Selektion (diese Platte dient als Hefe-Spotting und Wachstumskontrolle) unterhält. Verwenden einer zweiten Platte mit Medium, das für die Erhaltung des Plasmids und Expression des instabilen Protein an das Reporterenzym fusioniert auswählt. Da Hefe begleichen schnell, mischen Zellen durch Auf- und Abpipettieren in regelmäßigen Abständen.
   HINWEIS: Trockenplatten werden leichter absorbiert Flüssigkeit als frisch zubereiteten Platten und sind daher für diese Versuche zu empfehlen. Feuchten Platten können durch Inkubation bei Raumtemperatur in lo trocknendenw Luftfeuchtigkeit für 1 - 2 Tage oder kürzer Inkubationen in einer Haube mit laminarer Strömung. Platten können ungleichmäßig trocknen, wenn sich die laminare Luftströmung parallel zu der Bank. Verwendung einer Schablone erleichtert die Hefezellen in regelmäßigen Abständen zu erkennen. Zwei Mustervorlagen sind in Figur 1 zur Verfügung gestellt. Diese können gedruckt werden, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen.
6. Lassen Platten auf der Bank oben trocknen.
7. Inkubation erfolgt bei 30 ° C für 2 - 6 Tagen haben.
8. Fotografieren Sie jede Platte nach Inkubation.

Abbildung 1. Vorlagen für das Auffinden Hefezellen auf 100-mm-Agar-Platten. Diese Vorlagen können verwendet werden, um zu ermöglichen Spotting Hefe in regelmäßigen Abständen mit einem Mehrkanalpipette werden. Templates können ausgedruckt, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. Zeigen Petrischale mit WachstumMedium im Deckel mit Schablone angebracht. Vorlagen werden mit einer Einkerbung markiert, um Orientierung zu verfolgen. Es wird empfohlen, dass die Platten in Wachstumsassays verwendet in ähnlicher Weise mit einer Kerbe markiert werden, um die Orientierung zu verfolgen. Vorlagen für die Erkennung von vier (A) oder fünf (B) Reihenverdünnungen von Hefezellen zur Verfügung gestellt werden. Bitte klicken Sie hier um eine druckfähige Version dieser Figur mit 100-mm-Vorlagen zu sehen.

2. Biochemische Bestätigung des Hefe-Wachstumstest

1. Das Wachstum der Hefezellen und Post-Alkaline Proteinextraktion (von ³¹ modifiziert)
   1. Transform-Wildtyp und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid der instabilen Protein kodiert.
   2. Beimpfen von Transformanten in 5 ml SD-Medium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert.
   3. Messen Sie die _OD600 von jeder Nacht culture.
      HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen entweder in logarithmische oder stationäre Wachstumsphase sein, sollte aber eine OD ₆₀₀ die Verdünnung bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 in 10 ml frisches Selektivmedium (Schritt 2.1.4) erlauben wird erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt.
   4. Verdünne Hefezellen bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 in 10 ml frischem selektivem Medium.
   5. Weiter zu den Zellen bei 30 ° C inkubieren, Drehen oder Schütteln, bis Kulturen erreichen einer OD ₆₀₀ zwischen 0,8 und 1,2 (dh sind Mitte logarithmischen Wachstums).
      Hinweis: Wenn der instabile Protein von Interesse unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, kann die optimale Zeitsteuerung der Induktion der Proteinexpression und der Zellgewinnung nach den vorherigen Studien oder empirischen Beobachtungen variieren.
   6. Sammeln 2,5 OD ₆₀₀ Einheiten der Kultur in 15 ml konischenal Rohr durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
      Hinweis: eine _{OD600-Einheit} wird als die Menge der vorhandenen Hefe von 1 ml der Kultur bei einer OD ₆₀₀ von 1,0 definiert. V = 2,5 OD ₆₀₀ Einheiten / Mess OD _600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich, um 2,5 OD ₆₀₀ Einheiten (V) zu ernten kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden
   7. Zellen in 1 ml destilliertem Wasser. Übertragen suspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr.
   8. Pelle Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 xg für 30 sec bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
   9. Zellen in 100 ul destilliertem Wasser durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung, und fügen Sie 100 ul 0,2 M NaOH. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Proben für 5 min bei Raumtemperatur.
   10. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 x (von denen die meisten noch nicht veröffentlicht Proteine ​​und sind noch lebensfähig)g für 5 min. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
   11. Pellet in 50 bis 100 ul 1x Laemmli-Probenpuffer, die Zellen zu lysieren wird, durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbeln.
       HINWEIS: Die Entfernung des Alkaliüberstand nach Zentrifugation und anschließende Resuspension der Zellen in Laemmli-Probenpuffer extrahiert Proteine ​​bei einem pH-Wert mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kompatibel mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem und Western Blotting.
   12. Um vollständig zu denaturieren, Inkubation Lysate bei 95 ° C für 5 min.
       HINWEIS: Aggregation neigende Proteine ​​(zB Proteine ​​mit mehreren Transmembransegmente) können unlöslich werden, wenn sie bei 95 ° C inkubiert. Daher sollte Lysate bei niedrigeren Temperaturen inkubiert werden (zB 37 ° C - 70 ° C) für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt, für die Analyse von solchen Proteinen.
   13. Kühle Lysaten durch Anordnen auf Eis für 5 min.
   14. Zentrifuge Lysate bei 18000 g für 1 min bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletisieren. Trennen Sie den Überstand (in Lösung extrahierte Protein) durch SDS-PAGE vor der anschließenden Western Blot-Analyse (Abschnitt 2.2). Alternativ Shop Lysate bei -20 ° C.
2. Vertreter Western Blot Protokoll
   1. Laden empirisch ermittelten Volumen Lysate in einem SDS-PAGE-Gel.
   2. Führen Gel bei 200 V, bis Farbstofffront den Boden des Gels erreichte.
   3. Transferproteine ​​aus Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C.
   4. Block Membran durch Inkubation in 5% Magermilch in Tris-gepufferter Saline (TBS), schaukeln, für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
   5. Dekantieren Blockierungslösung.
   6. Dazu werden die Membranen mit primärem Antikörper, der für das Protein von Interesse (oder Epitoptag davon) in 1% Magermilch in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) für 1 h bei Raum temperatur, schaukeln.
   7. Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
   8. Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln.
      Hinweis: Da Fluorophore sind lichtempfindlich, sollte Verdünnungen fluorophorkonjugierten Antikörper im Dunkeln hergestellt werden. Zusätzlich sollte die Inkubation von Membranen in Gegenwart von fluorophorkonjugierten Antikörpern in lichtundurchlässigen Behältern auftreten. Dies kann durch Umwickeln Inkubationsschalen in Aluminiumfolie durchgeführt werden.
   9. Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
   10. Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
   11. Nach Abbilden Membran inkubieren der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für einen Lasting Kontrollprotein in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln.
   12. Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
   13. Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln.
   14. Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
   15. Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.

Ergebnisse

Diese Methodik zu veranschaulichen, hat das HIS3-Enzyms zu dem Carboxy-Terminus des Modells endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierte Abbau fusioniert (ERAD) -Substrat deg1 -Sec62 (2A) zu deg1 -Sec62-His3 schaffen (Figur 3) . deg1 -Sec62 eine Gründungsmitglied einer neuen Klasse von ERAD Substrate, die folgenden persistenten, anomale Verbindung mit dem Translokon ausgerichtet sind, wird der Kanal in erster Linie für die Bewegung Proteine ​​durch die E...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode erlaubt die schnelle Bestimmung und biochemischen Bestätigung genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau in Hefezellen. Diese Experimente unterstreichen den Nutzen und die Kraft der Hefe als Modell eukaryotischen Organismus (mehrere ausgezeichnete Bewertungen von Hefe Biologie und Zusammenstellungen von Protokollen für die Handhabung, Speicherung und Manipulation von Hefezellen (zB ^{41 bis 44)} sind für die Ermittler neue für den Organismus verfügbar). Die Techni...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components			Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole	Fisher Scientific	AC264571000	Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)	Roche	11088726001	May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped	Sarstedt	82.1581.001	Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl	Gilson	F14401	Available from a variety of manufacturers
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl	Gilson	F14403	Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System)	Bio-Rad	170-8195	A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater	Fisher Scientific	1172011AQ	Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application