Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Resumen

La degradación de proteínas regulado es crucial para prácticamente todas las funciones celulares. Gran parte de lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares y los requisitos genéticos para la degradación de proteínas eucariotas se estableció inicialmente en Saccharomyces cerevisiae. Los análisis clásicos de la degradación de proteínas se han basado en pulso-caza y cicloheximida-caza metodologías bioquímicas. Aunque estas técnicas proporcionan medios sensibles para la observación de la degradación de proteínas, que son laboriosos, consumen mucho tiempo, y de bajo rendimiento. Estos enfoques no son susceptibles de cribado rápido o a gran escala para las mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se describe un ensayo basado en el crecimiento de la levadura para la identificación fácil de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. En este ensayo, una enzima reportero requerido para el crecimiento bajo condiciones selectivas específicas se fusiona a una proteína inestable. Las células que carecen de la enzima reportero endógena pero que expresan la proteína de fusión puede crecer bajo selecondiciones ctive sólo cuando se estabiliza la proteína de fusión (es decir, cuando se ve comprometida la degradación de proteínas). En el ensayo de crecimiento descrito aquí, diluciones en serie de tipo salvaje y células de levadura mutantes que albergan un plásmido que codifica una proteína de fusión se manchan sobre medio selectivo y no selectivo. Crecimiento en condiciones selectivas es consistente con la degradación de deterioro por una mutación dada. El aumento de la abundancia de proteínas debe ser confirmada bioquímicamente. Un método para la rápida extracción de proteínas de levadura en una forma adecuada para la electroforesis y transferencia Western también se demuestra. Una lectura basada en el crecimiento para la estabilidad de la proteína, combinado con un protocolo sencillo para la extracción de proteína para el análisis bioquímico, facilita la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. Estas técnicas se pueden adaptar para controlar la degradación de una variedad de proteínas de vida corta. En el ejemplo presentado, la enzima His3, que se requiere para la biosíntesis de histidina, se fusionóa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación después de que encaje de forma aberrante translocón retículo endoplásmico. Las células que albergan Deg1 -Sec62-His3 fueron capaces de crecer en condiciones selectivas cuando se estabilizó la proteína.

Introducción

La degradación de proteínas selectiva es esencial para la vida eucariota, y la degradación de proteínas alterada contribuye a una serie de condiciones médicas, incluyendo varios tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, y la fibrosis quística ^1-5. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), que cataliza la degradación selectiva de proteínas, es una diana terapéutica emergente para estas condiciones ^6-10. Ubiquitina ligasas unir covalentemente polímeros de la ubiquitina de ácido 76-amino de proteínas ^11. Las proteínas que se han marcado con cadenas poliubiquitina son reconocidos y proteolizadas por los ~ 2.5 megadalton proteasoma 26S ^12. Los estudios iniciados en el organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido fundamental en la elucidación de los mecanismos de degradación de proteínas en células eucariotas. El primer sustrato fisiológico demostrada del UPS era la levadura represor transcripcional MATα2 ¹³, Primero se identificaron 14, y muchos componentes altamente conservadas de la UPS o caracterizadas en la levadura (por ejemplo, ^15-26). Los descubrimientos hechos en este modelo versátil y manejable de forma genética organismo es probable que continúe proporcionando importantes conocimientos sobre conservados mecanismos de degradación mediada por ubiquitina.

El reconocimiento y la degradación de la mayoría de los sustratos de UPS requieren la acción concertada de múltiples proteínas. Por lo tanto, un objetivo importante en la caracterización de la degradación regulada de una proteína dada es inestable para determinar los requisitos genéticos para la proteólisis. Los enfoques clásicos (por ejemplo de pulso-caza y experimentos cicloheximida-caza ²⁷⁾ para el seguimiento de la degradación de proteínas en células de mamífero o de levadura son laborioso y consume mucho tiempo. Si bien estos tipos de metodología proporcionan medios altamente sensibles para la detección de la degradación de proteínas, que no son adecuados para el análisis rápido de la degradación de proteína o Prueba de detección a gran escalang para mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se presenta un ensayo basado en un crecimiento de la levadura para la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de las proteínas inestables.

En el método basado en el crecimiento de la levadura para el análisis de la degradación de proteínas, una proteína inestable de interés (o señal de degradación) se fusiona, en marco, a una proteína que se requiere para el crecimiento de la levadura bajo circunstancias específicas. El resultado es un sustrato artificial que puede servir como una herramienta de gran alcance para determinar los requisitos genéticos de degradación de las proteínas de la proteína inestable de interés. Convenientemente, las cepas de levadura de laboratorio más comúnmente utilizados albergan un panel de mutaciones en genes que codifican enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos particulares o bases nitrogenadas (por ejemplo, ^20,28-30). Estas enzimas son esenciales para la proliferación celular en ausencia de proporcionadas exógenamente metabolitos en cuya síntesis las enzimas participan. Talenzimas metabólicas pueden así funcionar como reporteros basadas en el crecimiento de la degradación de las proteínas inestables a las que se fusionan. Los requisitos genéticos para la degradación de la proteína pueden ser dilucidado fácilmente, ya que las mutaciones que impiden la proteolisis se permitir que las células que albergan el reportero de la degradación crezcan bajo condiciones selectivas.

Una ventaja de crecimiento es una indicación indirecta de que una mutación particular aumenta la abundancia de la proteína de interés. Sin embargo, se requiere un análisis bioquímico directo a confirmar que una mutación permite el crecimiento mediante el aumento de los niveles de proteína en lugar de a través de las causas indirectas o artefactos. El efecto de una mutación en la abundancia de proteínas puede ser confirmado por Western blot de los niveles de proteína en estado de equilibrio en las células que hacen y no albergan la mutación particular. Un método para la extracción rápida y eficiente de las proteínas de levadura (incubación secuencial de células de levadura con hidróxido de sodio y tampón de muestra) en una forma adecuadapara el análisis por transferencia de Western también se presenta ^31. En conjunto, estos experimentos facilitar la rápida identificación de los reguladores candidatos de la degradación de proteínas.

Protocolo

1. Ensayo de crecimiento de la levadura para identificar mutantes candidatos defectuosos en la degradación de proteínas

1. Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica una proteína inestable fusionado, en cuadro, a una enzima metabólica reportero.
2. Inocular los transformantes en 5 ml de sintético definido (SD) medio mínimo que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
3. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ de cada cultivo de una noche.
   NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células en cultivo puede estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario, pero deberá haber alcanzado una OD ₆₀₀ de 0,2 mínimo. Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
4. Preparar seis veces diluciones en serie de células de levadura transformadas en una placa de 96 pocillos estériles, a partir de células diluidas a unan OD ₆₀₀ de 0,2. Coloque cada transformante de levadura a ensayar en una fila diferente en la placa de 96 pocillos.
   1. Para cada transformante, calcular el volumen de cultivo de una noche requerido para diluir las células hasta una DO ₆₀₀ de 0,2 en un volumen final de 200 microlitros. Añadir este volumen de cultivo durante la noche al pocillo correspondiente en la columna 1. Añadir la cantidad apropiada de agua estéril para llevar el volumen a 200 l.
   2. Para cada fila de la levadura, añadir 125 l de agua estéril a los pocillos en las columnas 2, 3, y 4.
      NOTA: placas de 96 pocillos estériles envueltas individualmente pueden envasarse con tapas estériles. Las tapas pueden ser utilizados como depósitos para el agua estéril que se distribuye en este paso. Esto permite la transferencia simultánea de agua estéril a todos los pocillos en una columna dada con una pipeta multicanal.
   3. Mezclar el contenido de la primera columna (levadura diluida a un OD ₆₀₀ de 0,2) pipeteando arriba y abajo con una pipeta multicanal.
   4. Transfer 25 l de levadura de la Columna 1 Columna 2, utilizando una pipeta multicanal. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Transferencia de 25 l de la Columna 2 a columna 3, y 25 l de la columna 3 a la columna 4 (mezclando bien en cada paso).
5. Mezclar cada muestra con una pipeta multicanal. Partiendo de más diluido para diluir menos columnas de levadura, pipeta de 4 l de cada muestra en dos placas que contenían el medio selectivo apropiado. Utilice una placa con medio que mantiene la selección del plásmido (Esta placa sirve como un manchado levadura y el control del crecimiento). Utilice una segunda placa con medio que selecciona para el mantenimiento del plásmido y la expresión de la proteína inestable fusionado a la enzima informadora. Debido a que la levadura resolver rápidamente, mezclar células pipeteando arriba y abajo a intervalos regulares.
   NOTA: Secador placas serán más fácilmente absorber líquidos que los platos recién preparados y por lo tanto se recomienda para estos experimentos. Placas húmedas se pueden secar por incubación a temperatura ambiente en low humedad durante 1-2 días o incubaciones cortas en una campana de flujo laminar. Las placas pueden secar de forma desigual si el flujo de aire laminar es paralelo a la mesa. El uso de una plantilla hace que sea más fácil de detectar células de levadura a distancias regulares. Dos plantillas de ejemplo se proporcionan en la Figura 1. Estos pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa.
6. Permita que las placas se sequen en la parte superior del banco.
7. Incubar las placas a 30 ° C durante 2-6 días.
8. Fotografiar cada placa después de la incubación.

Figura 1. Las plantillas para la detección de células de levadura en placas de agar de 100 mm. Estas plantillas se pueden usar para facilitar la detección de la levadura a distancias regulares con una pipeta multicanal. Las plantillas pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa. Coloque placa de Petri con el crecimientointerior de la tapa medio con plantilla fija. Plantillas están marcados con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Se recomienda que las placas utilizadas en los ensayos de crecimiento ser marcados de manera similar con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Plantillas para la detección de cuatro (A) o cinco (B) se proporcionan diluciones seriadas de células de levadura. Haga clic aquí para ver una versión imprimible de esta figura con plantillas de 100 mm.

2. Ensayo de confirmación bioquímica de crecimiento de la levadura

1. El crecimiento de células de levadura y Post-alcalina proteína Extracción (modificado de ³¹⁾
   1. Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica la proteína inestable.
   2. Inocular los transformantes en 5 ml de medio SD que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
   3. Mida el diámetro exterior ₆₀₀ de cada cu nochelture.
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células pueden estar en cualquier fase de crecimiento logarítmico o estática, pero han llegado a un OD ₆₀₀ que permita la dilución a un OD ₆₀₀ de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco (etapa 2.1.4). Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
   4. Diluir las células de levadura a un OD ₆₀₀ de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco.
   5. Continuar incubar las células a 30 ° C, rotación o agitación, hasta que los cultivos alcancen un OD ₆₀₀ entre 0,8 y 1,2 (es decir, están en crecimiento semilogarítmica).
      NOTA: Si la proteína inestable de interés está bajo el control de un promotor regulable, el momento óptimo de la inducción de la expresión de la proteína y la cosecha de células puede variar de acuerdo con estudios previos u observaciones empíricas.
   6. Recoger 2,5 OD ₆₀₀ unidades de cultivo en un 15 ml cónicaal tubo por centrifugación a 5000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
      NOTA: Una OD ₆₀₀ unidad se define como la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO ₆₀₀ de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) requerida para cosechar 2,5 OD ₆₀₀ unidades (V) se puede determinar usando la siguiente ecuación: V = 2,5 OD ₆₀₀ unidades / OD Medido ₆₀₀
   7. Resuspender las células en 1 ml de agua destilada. Transferencia de células suspendidas a un tubo de microcentrífuga.
   8. Sedimentar las células por centrifugación a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
   9. Resuspender las células en 100 l de agua destilada con la pipeta hacia arriba y abajo o vórtice, y añadir 100 l de 0,2 M de NaOH. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente.
   10. Células de pellets (la mayoría de los cuales aún no han lanzado proteínas y son todavía viables) por centrifugación a 18.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
   11. Resuspender pellet en 50 - 100 l de tampón de muestra Laemmli 1x, el cual lisar las células, pipeteando arriba y abajo o agitación con vórtex.
       NOTA: La eliminación del sobrenadante después de la centrifugación alcalina y posterior resuspensión de las células en tampón de muestra Laemmli extrae proteínas a un pH compatible con sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina y Western Blot.
   12. Para desnaturalizar completamente proteínas, se incuban los lisados ​​a 95 ° C durante 5 min.
       NOTA: Las proteínas de agregación propensos (por ejemplo, proteínas con varios segmentos de transmembrana) pueden llegar a ser insolubles cuando se incuba a 95 ° C. Por lo tanto, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo 37 ° C - 70 ° C) durante 10 a 30 min, determinado como empíricamente, para el análisis de tales proteínas.
   13. Super lisados ​​mediante la colocación en hielo durante 5 min.
   14. Centrifugar a lisados ​​18000 xg durante 1 min a temperatura ambiente para sedimentar el material insoluble. Separar el sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes del análisis de transferencia de western posterior (sección 2.2). Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C.
2. Representante Protocolo de Transferencia Western
   1. Cargar empíricamente determinado volumen de lisados ​​en un gel de SDS-PAGE.
   2. Ejecutar gel a 200 V hasta el frente de colorante ha alcanzado la parte inferior del gel.
   3. Transferencia de proteínas a partir de gel de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de la membrana por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C.
   4. Bloquear la membrana por incubación en leche descremada al 5% en Tris-solución salina tamponada (TBS), oscilación, durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
   5. Decantar la solución de bloqueo.
   6. Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés (o etiqueta de epítopo de los mismos) en 1% de leche desnatada en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 h en la sala de temperatura, meciéndose.
   7. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
   8. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo.
      NOTA: Debido a fluoróforos son sensibles a la luz, las diluciones de anticuerpos fluoróforo conjugado deben prepararse en la oscuridad. Además, la incubación de las membranas en la presencia de anticuerpos conjugado con fluoróforo debe ocurrir en recipientes a prueba de luz. Esto puede lograrse envolviendo las bandejas de incubación en papel de aluminio.
   9. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
   10. Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   11. Después de la formación de imágenes de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una cargaing proteína de control en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, meciéndose.
   12. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
   13. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo.
   14. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
   15. Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Resultados

Para ilustrar esta metodología, la enzima His3 se ha fusionado con el extremo carboxi-terminal del modelo de retículo endoplásmico (ER) la degradación -Associated (ERAD) sustrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para crear Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa uno de los fundadores de una nueva clase de sustratos ERAD que están dirigidos siguiente persistente, asociación aberrante con la translocon, el canal de los principales responsables de las ...

Discusión

La metodología que aquí se presenta permite la determinación rápida y la confirmación bioquímica de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas en células de levadura. Estos experimentos ponen de relieve la utilidad y el poder de la levadura como un organismo eucariota modelo (varios excelentes críticas de la biología de la levadura y compilaciones de protocolos para el manejo, almacenamiento y manipulación de células de levadura (por ejemplo ^41-44) están disponibles para...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components			Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole	Fisher Scientific	AC264571000	Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)	Roche	11088726001	May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped	Sarstedt	82.1581.001	Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl	Gilson	F14401	Available from a variety of manufacturers
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl	Gilson	F14403	Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System)	Bio-Rad	170-8195	A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater	Fisher Scientific	1172011AQ	Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application