隔膜的神经支配膈运动神经元的功能和形态评估

摘要

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

摘要

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

引言

肌萎缩性侧索硬化症（ALS）是与两个上和下运动神经元和随后的肌肉麻痹的损失相关联的衰弱运动神经元疾病。经诊断，病人的生存是唯一的2-5年平均^1。膈运动神经元（PhMN）损失是ALS发病机制的一个重要组成部分。患者最终死于PhMN支配膈肌，灵感^2,3的主要肌肉损失。外伤性脊髓损伤（SCI）也与相关联的呼吸困难的严重问题。每年⁴约12,000 SCI新病例发生是由于脊髓损伤创伤。尽管相对于位置，类型和严重程度的异质性疾病，多数SCI案件涉及外伤的脊髓型颈椎病，其结果往往是虚弱和持续性呼吸道妥协。除了ALS和脊髓损伤，其他中枢神经系统（CNS）的疾病可以关联瓦特第i膈肌呼吸功能障碍^5,6。

膈神经是传出运动神经支配是同侧半隔膜和源自位于同侧颈脊髓的C3-C5水平PhMN细胞体。 PhMN输出由在称为延髓腹侧呼吸组^（rVRG）7的区域降序从脑干bulbospinal输入控制。所述rVRG-PhMN隔膜电路是中央的吸气呼吸，以及其他非通气隔膜行为的控制。各种外伤和神经退行性疾病，影响该电路可导致呼吸功能及患者的生活质量产生深远的下降。下行输入从rVRG，PhMN生存，膈神经的完整性和适当神经支配的肌肉隔膜接头（NMJ）PhMNs都是必要的正常功能隔膜。它采用的技术，因此重要的是，可以定量地评价本电路在体内在ALS，脊髓损伤等中枢神经系统疾病的啮齿动物模型。

与此协议中，目标是描述实验工具用于评估在两个电生理学和形态学水平膜片PhMN支配。复合肌肉动作电位（的CMap）通过刺激一个给定的运动神经的所有传出的运动神经元的轴突，然后分析所述目标肌纤维的诱发的去极化应答被记录。此技术可用于在体内麻醉大鼠和小鼠的量化半膈由PhMNs ⁸的官能支配。由于这样的事实，的CMap表示同时记录所有（或至少许多/大部分）的整个半膈，它也检查个别运动轴突和肌纤维在膜片NMJ的表型，以便跟踪疾病是有用的肌纤维 - 和治疗相关的形态变化，如局部和完井德失神经支配，再生出芽及神经再支配。这可以通过在隔膜的整个贴装免疫组织化学（IHC）来完成，接着个体NMJs的详细的形态学评估整个肌肉^9。结合的CMap和NMJ分析提供了一个强大的方法定量研究膈神经支配的中枢神经系统和PNS疾病的啮齿动物模型。

研究方案

实验程序批准的托马斯·杰斐逊大学制度的动物护理和使用委员会，并符合欧洲共同体理事会指令（2010年/ 63 / EU，六百○九分之八十六/ EEC和87-848 / EEC），美国国立卫生研究院指南传导关心和使用实验动物，以及神经科学学会的在神经科学研究中使用动物的政策。

1.复合肌肉动作电位（的CMap）

1. 准备的动物:
   1. 麻醉使用吸入剂（异氟烷）在1-2％递送到作用或通过注射（氯胺酮，甲苯噻嗪，乙酰丙嗪）大鼠。注射麻醉的用量如下:95.0毫克/千克氯胺酮，10.0毫克/千克甲苯噻嗪，0.075毫克/千克乙酰丙嗪的。
      注:我们成功地同时使用吸入并进行该CMAP记录协议时，注射麻醉方法，没有偏好。
   2. 该动物必须保持在适当的一在手术前nesthetic深度开始，通过手术结束时，与直到手术后丁丙诺啡已生效。确认正确麻醉进行了简短的脚趾捏来确定一个撤军响应未引出。此外，测试角膜反射用棉签。整个手术过程中，确定心脏速率和呼吸率没有增加，这表明麻醉深度变得太轻。
   3. 适用于动物的眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。
   4. 外科医生应洗他/她的手开始术前消毒剂（洗必泰擦洗）。外科医生应戴无菌手套，口罩和礼服或干净的白大褂。所有仪器应洗净并在手术前高压灭菌。在高压灭菌仪器的水平，以验证灭菌完成之前添加的工具包内灭菌指示条。外科医生应验证钢带上的整条生产线是黑色的手术开始前。大盘在包装盒外面，指示釜磁带以及。如果手术是可以在几个动物在同一天进行的，清洁工具在手术之间和消毒，在一个玻璃珠灭菌。如果必要的话，通过将器械的手柄中的消毒器在适当的时间，用无菌止血钳除去仪器，冷却它在无菌场，然后放置的官能端消毒的玻璃珠灭菌仪器的两端仪器进入玻璃珠灭菌的时间适当的时期。
   5. 一旦动物被麻醉，代替外科板与背表面向下和腹部朝上以便带可用于保护动物的前肢外科板。
   6. 剃腹面尾端开始于颅底，并确保周围腹部上的中线的任一侧的区域是sh的AVED取决于哪个半膈正在被记录。适用碘伏对皮肤的剃表面。
2. 对于CMAP录音准备:
   1. 以下动物制备，地点接地电极皮下尾（ 图1）。
   2. 将参考电极皮下对侧下腹部区域。
   3. 将导体凝胶上自粘表面带或盘记录电极（表面条状电极的尺寸:0.5×3厘米），然后横向放置表面电极沿着单侧肋缘。
   4. 将刺激电极经皮0.5厘米除了横向到气管和优越的锁骨。将电极通过深层皮肤大约为1.0公分。固定用手电极使它们的位置不与随后的刺激移动。
      注:角度刺激电极90°相对于皮肤在insertio部位ñ。
3. 复合肌肉动作电位（CMAP）录音:
   1. 获得使用刺激/放大器其次是计算机辅助数据分析电生理记录。
   2. 单拉刺激刺激参数应为0.5毫秒，1.0赫兹超最大脉冲。刺激的幅度应介于6.0和8.0 V（ 图2A）。
      注:在一个实验中，使用刺激强度与整个动物相同的幅度。其目的是通过使用刺激的最小振幅最大化的响应幅度。要注意的是发生在刺激时的初始响应是刺激伪迹是很重要的。另外，应注意，以获得前面所述刺激伪迹，然后接着快速CMAP反应后稳定/平坦基线CMAP响应。为了得到这样的反应，可能需要重新定位的刺激和/或记录电极。
   3. 等待刺激之间30秒，并重复10刺激在一排，以获得平均响应（ 图2B - C）。测量从基线的幅度以峰（ 图2A）。在动物的呼吸循环的阶段进行膈神经刺激时膈神经/隔膜没有被激活。该过程可以重复在同一动物的对侧半侧隔膜。
   4. 最后CMAP记录会话后，灌注动物，如果染色NMJ将进行。每周进行反复录制CMAP在同一动物大约一次（或选择的时间间隔）。
   5. 继生存CMAP录音，让动物恢复，直到清醒和sternally横卧在恢复上一个温暖的循环水加热垫，并持续监测。不返回已经历手术给其他动物的公司，直到完全恢复的动物。
   6. 一旦sternally横卧，监测动物每12小时的第48小时（每日其后一次）。如果动物出现脱水（皮肤松弛，精神萎靡），辖液（乳酸林格氏液;皮下;每次注射1-2毫升，用旋转部位;每天2次），直到手术后的重量和流体损失稳定。在急性术后期间提供动物小碟软化食物，如果有必要鼓励吃，如果他们不能达到的电线杆盖进纸器。
   7. 施用丁丙诺啡以0.05毫克/千克手术结束前的剂量，然后在12小时的时间间隔的第一个24小时（和取决于疼痛/压力的迹象之后）经由皮下注射（现场旋转）。如果疼痛或痛苦的迹象后发现，对待动物与丁丙诺啡。标志指示性疼痛/窘迫包括缺乏活动，发声，进食不足或饮水（脱水），过度减肥，守着，EXCessive咬或抓现场切口。在确定疼痛和痛苦用其他标准包括无反应，以刺激无关，短暂或无端发声，吃力或反常呼吸，持续的红褐色鼻眼压放电，标志着竖毛。还监测卫生状况差，将建议患病动物的证据。如果动物仍然观察到72小时的治疗后要遇险（根据疼痛/应力的标准上面概述，以及接收后的镇痛协议如上所述）安乐死的动物。

2，神经肌肉隔膜接头（NMJ）分析

1. 动物解剖:
   1. 施用动物注射麻醉过量（3次剂量使用以上:氯胺酮在285.0毫克/千克，甲苯噻嗪以30.0毫克/公斤，乙酰丙嗪在0.225毫克/千克;腹腔内给药）。过量服用之后，所有的动物应该有安乐死（开胸）第二方法To确保死亡。死亡，应注意心脏和呼吸骤停，并指出动物的固定和瞳孔放大确认。
   2. 进行剖腹探查手术刀或夹层剪刀扩大切除从zyphoid过程尾端沿中线。小心用手术刀和镊子从下面的肌肉分开皮肤和结缔组织。
   3. 而在zyphoid过程拉起，用解剖剪去除整个膜片，以确保隔膜保持附着到周围骨中。这一点很重要，因为它会防止损坏隔膜肌肉，将允许整个膜片的成功解剖，将在清洗肌肉后续染色帮助。
      注意:在这一点上，动物如果需要可灌注。
2. 清洗和隔膜的染色:
   1. 拖住了整个解剖隔膜，优越的一面朝上，硅橡胶的玻璃百毫米培养皿中4％多聚甲醛（在1％的磷酸盐制成缓冲盐水 - PBS），用于使用立体显微镜20分钟。拉伸膜片，使其绷紧，并采用昆虫针，牵制周围组织，以避免钉扎隔膜肌肉本身（ 图3）。
   2. 肌肉与＃5镊子和小剪刀只有上表面仔细清理掉结缔组织。
      注:执行，除非另有说明这种染色协议缓缓摇摆在室温下涵盖了从光所有后续步骤。确保膈肌总是完全浸没液，以避免干燥。
   3. 染色前，准备所有必要的试剂:1×PBS，2％牛血清白蛋白（BSA）/ PBS，0.1M甘氨酸在2％BSA / PBS，4％多聚甲醛（PFA）中的1×PBS和0.2％TBP制成（0.2 ％的Triton X100在2％BSA / PBS）中。一定要预冷甲醇在-20℃。
   4. 洗3次为在1×PBS中的10分钟。
   5. 孵育在0.1M甘氨酸（在2发％BSA / PBS）30分钟。
   6. 孵育在RBTX（若丹明共轭α银环蛇毒素）溶液15分钟。解RBTX如下:若丹明共轭的α银环蛇毒素1:400稀释于1×PBS中。
      注意:在这个协议中，若丹明被使用，但所选择的任何荧光团可用于染色。
   7. 洗3次为在1×PBS中的10分钟。
   8. 在-20℃的冰箱中，孵育用MeOH 5分钟。
      注:将肌肉在冷冻之前不要添加甲醇，以及紧随其后的潜伏期删除解决方案。
   9. 洗3次为在1×PBS中的10分钟。
   10. 在0.2％磷酸三丁酯1小时块（0.2％Triton在2％BSA / PBS。制造）。
   11. 用初级抗体溶液（在0.2％TBP）在4℃孵育过夜，同时摇动。抗体的稀释如下:SV2（1:10）和SMI-312（1:1000）。
   12. 洗3次10分钟，用0.​​2％磷酸三丁酯。
   13. 孵育使用1的二级抗体:100稀释FGM1（FITC-缀合的山羊抗小鼠IgG的1;而摇动1小时制成0.2％TBP）。
       注:避光的协议染色的其余部分。
   14. 洗涤3×10分钟用1×PBS。
   15. 再清洁周围安装和盖片之前对肌肉的上（见上文）表面结缔组织。
       注:建议清洗，然后染色后立即装入样品。然而，如果需要的话，样品可以被覆盖在1×PBS中，包在石蜡膜以防止蒸发，并储存在4℃下长达1周，与改变的PBS（每天）。
   16. 在安装在玻璃载玻片，盖玻片与非hardset的Vectashield。密封盖玻片透明指甲油的边缘，以防止干燥。商店幻灯片长期平躺在硬纸板的幻灯片文件夹在-20℃。
3. 分析和共聚焦成像:
   1. 定量分析的染色形态，并安装在20X和40X放大倍率半振膜采用直立萤光显微镜。
      注:由于隔膜染色，并在整个安装的方式进行分析，肌肉颇浓。因此，大多数的荧光染色是完全失焦时的静态图像使用非共聚焦荧光显微镜拍摄。出于这个原因，最好是在开展实时分析NMJ在显微镜，因为这可以让你不断地关注"向上"和"向下"，通过肌肉的正确识别每一个单独的NMJs的形态。使用这种方法，可以很容易地按照个体运动轴突的轨迹，因为它们移动通过在空间关系突触后受体簇的组织。
   2. 通过测量肌肉的腹侧至背侧长度，除以肌成基于从特定脊髓水平（ 图4H）地形支配模式进行分析3个独立的部分。
   3. 在肌肉和MOV的腹侧区域开始荷兰国际集团背侧，分析所有带位于表面肌纤维的脸NMJs。不分析肌肉纤维比从表面上的第一3-4纤维更深作为解释可能是困难的，由于较差的抗体渗透（RBTX穿透更深的进入肌肉由于毒素的小尺寸相比用于标记较大抗体神经元）。
   4. 识别每个NMJ作为完整如果神经元的预终端轴突是厚的直径和神经终端的所有区域与下面的肌肉的乙酰胆碱受体（乙酰胆碱受体）完全重叠。
   5. 识别每个NMJ为部分失神经支配，如果底层肌肉乙酰胆碱受体的任何地区是无人居住的相应神经末端。
   6. 识别每个NMJ尽可能完全失神经如果肌肉乙酰胆碱受体有没有相应神经末端（它也是重要的是有其他NMJs与焦点的相同字段标记的神经元，这样一方面可以确保缺乏神经末端的不单纯是由于便便中的R肌肉的该区域的抗体的渗透）。
   7. 识别每个NMJ作为乘法支配，如果有一个以上的预终端轴突神经支配的个体NMJ（这表明出现了去神经和神经支配恢复的可能尝试的一些水平在该路口）。
   8. 每个标识作为NMJ支配清淡如果NMJ有神经末梢与乙酰胆碱受体底层之间完全重叠，但有一个薄预终端轴突（这也表明了去神经支配和企图的神经再支配一定程度）。
   9. 进行分析对于每一个用于上述所有NMJ类别对每只动物3识别区域。从每只动物与来自其他动物的结果来自同一个实验组平均化的数据。在小鼠半膈大鼠半侧膈肌和150-200大约200-300结应该量化在每个实验组的至少3个（优选5-6或更多）的动物。
   10. 获得高分辨率的共聚焦图像，使用d表示出版物，用共聚焦显微镜。
   11. 得到的Z-堆叠在0.3微米的步长为20-40微米的深度，并收集上述各结下面附加的光学部分，以确保整个突触信息被包括。
   12. 用采集软件重建的Z系列图像到最大强度的预测。

结果

成年SD大鼠接受椎板切除术或者只（无恙的控制），或单侧半挫伤SCI在C4脊髓水平^10-12。在5周后，手术，峰CMAP波幅记录从半膈同侧椎板/损伤部位中的SCI大鼠（ 图2C）中的显著减少相比椎板仅控制（ 图2B）。在半膈所有NMJs均在控制未患病的野生型大鼠（ 图4A中的C）完全不变。与此相反，SOD1 ^G93A大鼠（ALS的啮齿动物模型）显示显著病理学在半膈N...

讨论

由于呼吸功能受到损害双方在外伤性脊髓损伤和ALS，开发针对呼吸和具体隔膜神经支配疗法是临床相关^5,6。为了全面考察呼吸功能，应使用相结合的办法方法。的CMap测量膜片由外部膈神经的刺激方式的功能性神经支配的程度，但不是内源bulbospinal呼吸驱动^8。此外，这些录音不允许检查在NMJ形态变化，特别是在个人的运动轴突和突触后乙酰胆碱受体的水平。通过使用所描述的染色?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP