Функциональная и морфологическая оценка диафрагмы иннервации диафрагмального по мотонейронов

Резюме

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Аннотация

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Введение

Боковой амиотрофический склероз (БАС) является изнурительных болезнь двигательных нейронов, связанные с потерей верхних и нижних моторных нейронов и, как следствие паралич мышц. По диагностике, выживаемость пациентов в среднем на 2-5 лет только ^1. Диафрагмального двигательных нейронов (PhMN) потеря критическим компонентом патогенеза БАС. Пациенты, в конечном счете умирают из-за потери PhMN иннервации диафрагмы, основной мышцы вдохновения ^2,3. Травматический травмы спинного мозга (ТСМ), также серьезная проблема с затрудненным дыханием, связанных. Приблизительно 12000 новых случаев SCI происходит каждые ⁴ года в связи с травматическим повреждением спинного мозга. Несмотря заболевания неоднородности по отношению к местоположения, типа и тяжести, большинство случаев SCI привлекать травму шейного отдела спинного мозга, что часто приводит к изнурительной и упорной дыхательной недостаточности. В дополнение к ALS и ТСМ, другие центральной нервной системы (ЦНС), заболевания могут быть связаны WIth диафрагмальной дыхательной дисфункции ^5,6.

Диафрагмальный нерв двигательный нерв, который иннервирует эфферентной ипсилатерального полугидрата диафрагму и происходит от PhMN клеточных тел, расположенных в уровне С3-С5 ипсилатеральных шейного отдела спинного мозга. Выход PhMN контролируется убыванию Bulbospinal вход от мозга в области, известной как ростральной брюшной дыхательных группы (rVRG) ^7. RVRG-PhMN диафрагмой схема является центральным контролем вдоха дыхание, а также других не-вентиляционных поведения диафрагмы. Различные травматические повреждения и нейродегенеративные расстройства, которые влияют на эту схему может привести к резкому сокращению дыхательной функции и качества жизни пациентов. Убыванию вклад в PhMNs от выживания rVRG, PhMN, диафрагмального нерва целостности и надлежащего иннервации в нервно-мышечном соединении диафрагмы (НМС) все необходимое для нормальной функции диафрагмы. Поэтому важно использовать методы, которыеколичественно оценить эту схему в естественных условиях на моделях грызунов АЛС, SCI и других заболеваний ЦНС.

С этого протокола, цель описать экспериментальные инструменты для оценки PhMN иннервации диафрагмы как на электрофизиологические и морфологические уровнях. Соединение мышц потенциалы действия (CMAPs), отражаются путем стимулирования все эфферентной двигательных нейронов аксоны данного двигательного нерва, а затем анализируя вызываемые деполяризации ответ целевых мышечных волокон. Этот метод может быть использован в естественных условиях в анестезированных крыс и мышей количественно функциональной иннервации геми-диафрагмы по PhMNs ^8. В связи с тем, что CMAPs представляете одновременную запись всех (или, по крайней мере, многие / большинство) мышечных волокон в целом Hemi-диафрагма, это также полезно изучить фенотипы отдельных аксонов двигательных и мышечных волокон на НМС диафрагмы для того, чтобы отслеживать болезни - и терапия актуальных морфологические изменения, такие как частичная и Комплексыте денервация, регенеративная прорастания и реиннервация. Это может быть достигнуто с помощью целом монтажа иммуногистохимии (IHC) диафрагмы, с последующим подробным морфологической оценки отдельных НМС по всей мышце ^9. Сочетание CMAPs и НМС анализ обеспечивает мощный подход к количественной изучения диафрагмы иннервации в моделях грызунов ЦНС и ПНС болезни.

протокол

Экспериментальные процедуры были одобрены Университет Томаса Джефферсона институциональная по уходу за животными и использование комитета и проводится в соответствии с Директивой Совета Европейских Сообществ (2010/63 / ЕС, 86/609 / EEC и 87-848 / ЕЕС), Руководстве NIH для уход и использование лабораторных животных, и общество Политика неврологии на использовании животных в области нейронаук.

1. Соединение Мышечные потенциалы действия (CMAPs)

1. Подготовка животных:
   1. Обезболить крысу, используя для ингаляции (ИФ) в 1-2% доставлено эффекта или инъекции кетамина (, ксилазина, ацепромазина). Дозировка инъекций анестезии заключается в следующем: 95,0 мг / кг кетамина, 10,0 мг / кг ксилазина, 0,075 мг / кг ацепромазина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы успешно использовать как ингал и инъекционный анестетик подходы при проведении этого протокола записи CMap, без предпочтений.
   2. Животное должно поддерживаться на надлежащем Anesthetic глубина до операции началась, путем заключения операции, и до тех пор, послеоперационный бупренорфина не вступило в силу. Подтвердите правильное обезболивания при кратковременном пальца щепоткой определить, что ответ вывод не вызывал. Кроме того, проверить роговицы рефлекс ватным тампоном. На протяжении хирургической процедуры, определить, что частота сердечных сокращений и частота дыхания не увеличилась, что говорит о том, что глубины анестезии стал слишком легкий.
   3. Нанесите мазь на ветеринара глаза животного, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
   4. Хирург должен вымыть ее / его руки с дезинфицирующим средством (хлоргексидин скраб) перед началом операции. Хирург должен носить стерильные перчатки, маску и халат или чистый халат. Все инструменты должны быть вымыты и в автоклаве до операции. Добавить индикатор стерилизации полосу внутри комплекта инструмента перед автоклавированием на уровне инструментов, чтобы убедиться, что стерилизации завершен. Хирург долженубедиться, что вся линия на полосе черный перед началом операции. Лента за пределами коробки с указанием автоклав ленты, а также. Если операция должна быть выполнена на нескольких животных в тот же день, чистить инструменты между операций и стерилизовать в бисер стерилизатор. При необходимости, стерилизовать оба конца инструмента в бисер стерилизатор путем размещения ручку прибора в стерилизатор для соответствующего времени, удаление инструмент с помощью стерильного кровоостанавливающего, охлаждая его в стерильной зоне, а затем размещения функциональную конец инструмент в бисер стерилизатор для соответствующего периода времени.
   5. После животное анестезировали, место на хирургической доске с дорсальной поверхности вниз и живота вверх так, что лента может быть использована для обеспечения передние конечности животного к хирургическому борту.
   6. Бритье вентральной поверхности каудально, начиная с основания черепа, и убедитесь, что область вокруг живота по обе стороны от средней линии является шaved в зависимости от геми-диафрагмы записывается. Применение повидон-йода на бритой поверхности кожи.
2. Подготовка к CMap записей:
   1. После подготовки животных, место заземления электрода подкожно в хвосте (рис 1).
   2. Поместите электродный подкожно в противоположной нижней области живота.
   3. Поместите проводящий гель на самоклеющейся поверхности полосы или записи диска электрода (размеры поверхности ленточным электродом: 0,5 х 3 см), а затем поместить поверхности электрода в поперечном направлении одностороннего реберного края.
   4. Поместите стимулирующие электроды транскутанно 0,5 см друг от друга боковые трахее и превосходные ключицы. Вставка электродов примерно 1.0 см в глубину через кожу. Закрепите электроды от руки так, чтобы их расположение не двигаться с последующими раздражений.
      Примечание: Угол стимулирующих электродов 90 ° по отношению к коже в месте insertioп.
3. Соединение мышц потенциала действия (CMAP) записи:
   1. Получить электрофизиологические записи, используя стимулятор / усилитель с последующим анализом данных компьютерной помощь.
   2. Параметры стимул одного стимуляции выдвижной должно быть 0,5 мс, 1,0 Гц импульсов сверхмаксимальном. Амплитуда стимула должно быть между 6,0 и 8,0 В (фиг.2А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве эксперимента, использовать интенсивность стимула с той же амплитудой через животных. Цель состоит в том, чтобы максимально увеличить амплитуду отклика с помощью минимальную амплитуду стимуляции. Важно отметить, что первоначальный ответ, который происходит во время стимуляции стимуляции артефакт. Кроме того, следует позаботиться, чтобы получить ответ, что CMap предшествует стабильной / плоской базовой после стимуляции артефакт, который затем следует быстрое реагирование СМАР. Для того чтобы получить такую ​​реакцию, может быть необходимо, чтобы изменить стимуляцию и / илиЗапись электроды.
   3. Подождите 30 сек между раздражениями, и повторите 10 стимуляции в ряд, чтобы получить среднюю реакцию (рис 2B - С). Измерьте амплитуду от базовой линии до пика (рис 2А). Провести диафрагмального нерва во время фазы дыхательного цикла животного, когда диафрагмального нерва / мембрана не активирована. Эта процедура может быть повторен на той же животного на контралатеральной геми-диафрагмы.
   4. После заключительной сессии записи СМАР, заливать животное, если окрашивание НМС будет проводиться. Провести CMap записи неоднократно на тех же животных примерно раз в неделю (или с интервалом в выборе).
   5. После выживания CMap записей, позволяют животным, чтобы восстановить на циркулирующей теплый водяной подушкой, и постоянно следить во время восстановления до активного и sternally лежачие. Не возвращать животное, претерпела операцию на компании других животных до полного восстановления.
   6. После sternally лежачие, контролировать животное каждые 12 ч в течение первых 48 часов (один раз в день после этого). Если животное кажется, обезвоженной (вялый кожи, вялость), управлять жидкости (лактат Рингера раствор; подкожно; 1-2 мл на инъекцию, с сайтов поворачивается; 2 раза в день) до пост-хирургической веса и потеря жидкости стабилизируется. Обеспечить животных с размягченным пищи в небольших блюд во время острой послеоперационном периоде при необходимости поощрять еде, если они не могут достичь бар крышки механизма подачи проволоки.
   7. Администрирование бупренорфин в дозе 0,05 мг / кг до конца операции, а затем в течение 12 ч с интервалом в 24 часов первого (и зависит от симптомов боли / напряжения после) с помощью подкожной инъекции (участок повернут). Если признаки боли или дистресса заметил после этого относиться к животным с бупренорфином. Признаки, указывающие на боли / бедствия включают в себя отсутствие активности, вокализации, отсутствие еды или питья (обезвоживание), чрезмерной потери веса, охрана, отлщий грызть или царапать на сайте разрез. Дополнительные критерии, используемые при определении боль и страдания включают невосприимчивость к посторонним стимулов, переходные или спровоцированное вокализации, затрудненное дыхание или ненормальное, стойкое красновато-коричневый носо-occular разряда, отмеченные пилоэрекцию. Также мониторинг доказательства плохой гигиены, что можно было бы предположить больных животных. Если животное все еще наблюдается быть в дистресс после 72 ч обработки (в соответствии с критериями боль / стресса очертить выше, и после получения описано выше протокол анальгетик) эвтаназии животных.

2. Диафрагма нервно-мышечного соединения (НМС) Анализ

1. Животное рассечение:
   1. Администрирование животное передозировки инъекций анестезии (3 раза дозу использовать выше: кетамин на 285,0 мг / кг, ксилазина на 30,0 мг / кг, ацепромазина на 0,225 мг / кг; вводили внутрибрюшинно). После передозировки, все животные должны иметь второй способ эвтаназии (торакотомии) тО обеспечения смерть. Смерть должна быть подтверждена путем наблюдения сердечной и дыхательной ареста и отметить фиксированные и расширенные зрачки животного.
   2. Провести лапаротомии с скальпель или ножницы рассечение продления иссечение с zyphoid процесса каудально вдоль средней линии. Аккуратно отделите кожу и соединительную ткань от основной мышцы с использованием скальпеля и пинцета.
   3. В то время как подтягивание на zyphoid процесса, использовать рассечение ножницами, чтобы удалить всю диафрагму, обеспечивая диафрагма остается прикрепленной к окружающей кости. Это важно, поскольку это поможет предотвратить повреждения мышц диафрагмы, позволит успешного вскрытия всей диафрагмы и поможет в очистке мышцы для последующего окрашивания.
      Примечание: В этот момент животное может быть перфузии, если это необходимо.
2. Очистка и окрашивание диафрагмы:
   1. Придавить весь расчлененный диафрагму, превосходит поверхностью вверх, чтобы силиконовой резины в стакане 100 мм чашки Петри в4% параформальдегида (сделано в 1% фосфатном буферном растворе PBS) - в течение 20 мин с помощью стереомикроскопа. Стретч диафрагму, чтобы сделать его тугой, и с помощью насекомых булавками, придавить окружающие ткани, чтобы избежать закрепления сам мышцы диафрагмы (рисунок 3).
   2. Тщательно очистите от соединительной ткани только из верхней поверхности мышцы с # 5 щипцов и маленькими ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги этого протокола окрашивания медленно покачиваясь при комнатной температуре, покрытой от света, если не указано иное. Убедитесь, что мышцы диафрагмы всегда полностью погружен в жидкость, чтобы избежать высыхания.
   3. Перед окрашиванием, подготовить все необходимые реагенты: 1X PBS, 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) / PBS, 0,1 М глицин производится в 2% БСА / PBS, 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS, и 0,2% ТБФ (0,2 % Тритон Х100 в 2% BSA / PBS). Будьте уверены, что для предварительного охлаждения метанол при -20 ° С.
   4. Промыть 3 раза в течение 10 мин в 1x PBS.
   5. Выдержите в 0,1 М глицина (сделано в 2% БСА / ЗФР) в течение 30 мин.
   6. Инкубируют в RBTX (родамин-конъюгированного α-бунгаротоксина) раствор в течение 15 мин. Раствор для RBTX заключается в следующем: родамин-конъюгированного альфа бунгаротоксина разведение 1: 400 в 1х PBS.
      Примечание: В этом протоколе используется родамин, но любой флуорофор выбора может быть использован для окрашивания.
   7. Промыть 3 раза в течение 10 мин в 1x PBS.
   8. В -20 ° C морозильнике, инкубировать МеОН в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте МеОН до размещения мышцы в морозильной камере, и сразу же удалить решение после инкубационного периода.
   9. Промыть 3 раза в течение 10 мин в 1x PBS.
   10. Блок в 0,2% ТБФ в течение 1 ч (0,2% Triton выполнен в 2% BSA / PBS).
   11. Инкубируйте с первичным раствора антител (0,2% в ТБФ) при 4 ° С в течение ночи в то время качания. Растворы антител следующим: SV2 (1:10) и SMI-312 (1: 1000).
   12. Промыть 3 раза в течение 10 мин с 0,2% ТБФ.
   13. Инкубируйте с вторичными антителами с использованием 1: 100 разбавление FGM1 (FITC-конъюгированного козьего антитела против мышиного IgG1; выполнен в 0,2% ТБФ) в то время качания в течение 1 часа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Защищать от света для остальной части протокола для окрашивания.
   14. Промыть 3 раза в течение 10 мин с 1x PBS.
   15. Re-чистой окружающей соединительной ткани на верхней (см выше) поверхности мышцы перед монтажом и coverslipping.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы очистить, а затем смонтировать образец сразу же после окрашивания. Тем не менее, если это необходимо, образцы могут быть покрыты в 1x PBS, завернутые в парафином, чтобы предотвратить испарение и хранили при 4 ° С в течение до 1 недели, с изменением РФБ ежедневно.
   16. По монтажа на стекло, покровное с не-hardset Vectashield. Печать края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание. Храните слайды лежа в картонные слайд папки -20 ° С в течение длительного срока.
3. Анализ и конфокальной микроскопии:
   1. Количественного анализа морфологии окрашенных и установлен полугидрата диафрагму под 20-кратным и 40-кратном увеличении с использованием вертикально эпифлуоресцентноймикроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за диафрагма окрашенных и проанализированы в целом монтажа моды, мышцы довольно толстый. Следовательно, большая часть флуоресцентного окрашивающего полностью в фокусе, когда статическое изображение принимается с использованием не-конфокальной флуоресцентной микроскопии. По этой причине, лучше всего проводить анализ NMJ в режиме реального времени на микроскоп, так как это позволяет постоянно сосредоточиться "вверх" и "вниз" через мышцы правильно определить морфологию каждого из отдельных НМС. Используя этот подход, можно легко следить траекторию отдельных аксонов двигательных, как они движутся через ткань в пространственной связи с пост-синаптических рецепторов кластеров.
   2. Измеряя вентральной к спинной-длину мышцы, мышцы разделить на 3 отдельных секций для анализа на основе топографических моделей иннервации из спинного конкретных уровней мозга (рис 4H).
   3. Начиная с вентральной области мышц и MOVING спинки, анализировать все анфас NMJs, расположенных на поверхности мышечных волокон. Не проанализировать мышечных волокон глубже, чем первые 3-4 волокон с поверхности, как интерпретация может быть затруднена из-за более низкого к проникновению антител (RBTX проникает глубже в мышцу из-за небольшого размера токсина по сравнению с более крупными антител, используемых для обозначения нейроны).
   4. Определить каждый НМС неповрежденными, если предварительно терминал аксона нейрона толщиной в диаметре и все регионы нервных окончаний полностью перекрываются с основными рецепторами мышц ацетилхолина (АХР).
   5. Определить каждый НМС как частично денервированная если область лежащих в основе АХР мышечных никого с соответствующими нервные окончания.
   6. Определить каждый НМС, как полностью денервированная если мышечные АХР никогда не соответствующих нервных терминал (это также важно, чтобы другие NMJs с меченных нейронов в той же области фокуса, так что можете быть уверены, отсутствие нервных окончаний не просто из-за пуг проникновение антител в этой области мышцы).
   7. Определить каждый НМС, как размножаются иннервируются если есть более чем один терминал предварительно аксона иннервирующих индивидуальный НМС (это означает, что имело определенный уровень денервации и вероятных попыток реиннервации на этом перекрестке).
   8. Определить каждый НМС, как тонко иннервируются если НМС имеет полное перекрытие между терминалом нерва и базовых АХР, но имеет тонкую предварительно терминала аксона (это также свидетельствует о некотором уровне денервации и попыток реиннервации).
   9. Провести анализ для каждого из 3 определенных регионах для всех вышеперечисленных категорий NMJ для каждого животного. Среднее значение на основании данных от каждого животного с результатами других животных из той же экспериментальной группы. Примерно 200-300 переходов в крыс Hemi-диафрагма мышцы и 150-200 в мыши полугидрата диафрагмы должны быть количественно, по крайней мере 3 (предпочтительно 5-6 или более) животных в экспериментальной группе.
   10. Получить конфокальной изображения с высоким разрешением, использованиеd для публикации, с конфокальной микроскопии.
   11. Получить Z-стеки на 0,3 мкм размер шага в течение 20-40 мкм глубины, и собрать дополнительные оптические разделы выше и ниже каждого перехода для того, чтобы вся синаптической профиль включен.
   12. Используйте программное обеспечение сбора, чтобы восстановить изображения Z-серии в максимальной проекции интенсивности.

Результаты

Взрослые Спрэг Dawley крысам либо ламинэктомию только (пострадал управления) или одностороннее Hemi-ушиб SCI на С4 уровне спинного мозга ^10-12. В 5 недель после операции, максимальная амплитуда СМАР записан с Hemi-диафрагма ипсилатеральная на сайт ламинэктомию / травмы была значительно сниж?...

Обсуждение

Как дыхательная функция нарушена и в травматическом ПСМ и БАС, разработки методов лечения, которые нацелены дыхание и, в частности диафрагмы иннервации являются клинически значимыми ^5,6. Для того, чтобы всесторонне изучить дыхательную функцию, комбинированный метод подход должен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP