Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

Özet

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Özet

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Giriş

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), üst ve alt motor nöron ve buna bağlı olarak, kas felci, hem kaybı ile bağlantılı bir zayıflatıcı motor nöron hastalığıdır. Tanı üzerine, hasta sağ kalım ortalama sadece 2-5 yıl ¹ üzerindedir. Frenik motor nöron (PhMN) zarar ALS patogenezinde kritik bir bileşenidir. Hastalar sonuçta nedeniyle diyaframın PhMN innervasyonu, ilham ^2,3 birincil kas kaybı ölmektedir. Travmatik omurilik yaralanması (SKY) da ilişkili solunum güçlüğü ile ciddi bir sorundur. SCI yaklaşık 12.000 yeni vaka nedeniyle omuriliğe travmatik hasar her yıl ⁴ oluşur. Konumu, türü ve şiddetine göre hastalık heterojenite rağmen, SCI vakaların çoğunluğu genellikle zayıflatıcı ve kalıcı solunum uzlaşma ile sonuçlanan servikal spinal kord, travma içerir. ALS ve SCI ek olarak, diğer merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları w ilişkilendirilebiliri'inci diyafragma solunum fonksiyon bozukluğu ^5,6.

frenik sinir ipsilateral hemi-diyaframı innervates bir efferent motor sinir olduğunu ve aynı taraftaki servikal spinal kord C3-C5 düzeylerinde bulunan PhMN hücre gövdeleri kaynaklanır. PhMN çıkışı rostral ventral solunum grubunda (rVRG) ⁷ olarak bilinen bir bölgede beyin sapından bulbospinal girdi inen tarafından kontrol edilir. rVRG-PhMN-diyafram devre inspiratuar solunum yanı sıra diğer non-solunum diyafram davranışları kontrol merkezidir. Bu devrelere etkileyen çeşitli travmatik yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar, solunum fonksiyon ve hastanın yaşam kalitesinde düşüşe derin yol açabilir. Diyafram nöromüsküler bileşke (NMJ) de rVRG, PhMN hayatta kalma, frenik sinir bütünlüğü ve uygun innervasyonunun gelen PhMNs girdi Azalan Normal diyafram fonksiyonu için gerekli tüm vardır. Bu teknikler istihdam nedenle önemli olduğunukantitatif ALS, omurilik yaralanması ve diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarının, kemirgen modellerinde in vivo olarak bu devre değerlendirebilir.

Bu protokol ile, hedef elektrofizyolojik ve morfolojik düzeyde hem de diyaframın PhMN innervasyonu değerlendirmek için deneysel araçları tanımlamaktır. Bileşik kas aksiyon potansiyelleri (Cmaps) verilen bir motor sinirin tüm efferent motor nöron aksonları uyarıcı ve daha sonra hedef myofibers bir ortaya çıkardı depolarizasyon tepkisini analiz ederek kaydedilir. Bu teknik, PhMNs ⁸ ile hemi-diyafram fonksiyonel innervasyon ölçmek için anestezi uygulanmış farelerde ve sıçanlarda in vivo olarak kullanılabilir. Nedeniyle Cmaps hemi-diyafram bütün, aynı zamanda hastalığa izlemek için diyafram NMJ bireysel motorlu akson ve myofibers fenotipleri incelemek yararlıdır tüm (ya da en azından birçok / en) myofibers eşzamanlı kayıt temsil gerçeği - ve bu tür parsiyel ve komple olarak tedavi açısından önemli morfolojik değişimlerte denervasyon, rejeneratif filizlenme ve reinnervation. Bu kas ⁹ genelinde bireysel NMJs detaylı morfolojik değerlendirmenin ardından, diyaframın tüm montaj immünohistokimya (İHK) üzerinden gerçekleştirilebilir. Cmaps birleştiren ve NMJ analiz nicel MSS ve PNS hastalığı kemirgen modellerinde diyafram innervasyon çalışmak için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır.

Protokol

Deneysel işlemler Thomas Jefferson Üniversitesi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış ve (86/609 / EEC ve 87-848 / EEC 2010/63 / AB), Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi, NIH Kılavuzu ile uyumlu yapılmıştır bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı ve Nörobilim Araştırma Hayvanların Kullanımına İlişkin Neuroscience adlı Politikalar Derneği.

1. Bileşik kas Aksiyon Potansiyelleri (Cmaps)

1. Hayvan hazırlanması:
   1. Enjeksiyonu (ketamin, ksilazin, asepromazin) etkisi veya teslim% 1-2 bir inhalant (izofluran) kullanarak sıçan anestezisi. Ketamin 95.0 mg / kg, 10.0 mg / ksilazin kg, 0.075 mg / kg asepromazin aşağıdaki gibi enjekte edilebilir anestezi dozajdır.
      NOT: Biz başarıyla hem inhalant kullanabilir ve bu CMAP kayıt protokolü yaparken enjektabl anestezi hiçbir tercihle, yaklaşımlar.
   2. Hayvan uygun a muhafaza edilmelidirAmeliyat öncesi nesthetic derinlik ameliyatı sonucunda yoluyla başlatılır ve post-operatif buprenorfın kadar etkili almıştır. Bir geri çekme tepkisi ortaya olmadığını belirlemek için kısa ayak tutam tarafından uygun anesthetization onaylayın. Ayrıca, bir pamuklu çubukla kornea refleksi sınayın. Cerrahi işlem boyunca, kalp hızı ve solunum sayısı anestezi derinliği çok hafif hale geldiğini ileri süren artış olmamıştır belirlemek.
   3. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri bir veteriner merhem sürün.
   4. Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin fırçalayın) ile / ellerini ona yıkamak gerekir. Cerrah, steril eldiven, yüz maskesi ve cüppe veya temiz laboratuvar önlüğü giymeli. Tüm enstrümanlar yıkanır ve ameliyat öncesi otoklava edilmelidir. Bu sterilizasyon işlemi tamamlandıktan doğrulamak için araçların seviyesinde otoklav önce alet kiti içinde bir sterilizasyon göstergesi şeridi ekleyin. Cerrah gerekirStrip tüm çizgi ameliyat başlamadan önce siyah olduğunu doğrulayın. Yanı sıra otoklav bandı gösteren kutunun dışını bantlayın. Cerrahi aynı gün birkaç hayvanlar üzerinde yapılacak olursa, ameliyatlar arasında aletleri temizlemek ve cam boncuk sterilizatör sterilize edin. Gerekirse, steril hemostatla aleti kaldırarak, uygun süre sterilizatör enstrümanın kolu yerleştirerek steril bir alanda soğutulması ve daha sonra fonksiyonel ucunu yerleştirerek cam boncuk sterilizatör enstrümanın iki ucunu sterilize zaman uygun bir süre için cam boncuk sterilizatör içine alet.
   5. Hayvan anestezi edildikten sonra, aşağı dorsal yüzeyi ile cerrahi gemide ve böylece bant yukarı bakacak karın yerde cerrahi kuruluna hayvanın ön ayakları korumak için kullanılabilir.
   6. Kafatasının dibinde başlayan ventral yüzey kaudal Tıraş ve orta hat her iki tarafında karın çevresi sh olduğundan emin olunaved hemi-diyafram kaydedilirken bağlı olarak hangi. Cilt traş yüzeyine povidon-iyot uygulayın.
2. CMAP kayıtları için hazırlık:
   1. Kuyruk içine hayvan hazırlama, yer zemin elektrot deri altına takiben (Şekil 1).
   2. Kontralateral alt karın bölgesi içine referans elektrot deri altına yerleştirin.
   3. Kendinden yapışkanlı yüzey şerit veya disk kayıt elektrot (yüzey şerit elektrot boyutları: 0,5 x 3 cm) üzerine iletken jel yerleştirin ve sonra tek taraflı kot kenarı boyunca enine yüzey elektrodu yerleştirin.
   4. Transkutanoz 0.5 cm arayla trakea lateral ve klavikula üstün uyarıcı elektrotlar yerleştirin. Deri yoluyla yaklaşık 1.0 cm derinliğinde elektrotlar yerleştirin. Onların yeri daha sonraki uyarılara ile hareket etmez, böylece elle elektrotlar sabitleyin.
      Not: yapışma yeri yerinde cilde 90 ° görece açı uyarıcı elektrotlarn.
3. Bileşik kas Aksiyon Potansiyeli (CMAP) kayıtları:
   1. Bilgisayar destekli veri analizi ve ardından bir uyarıcısı / amplifikatör kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar edinin.
   2. Tek çekme stimülasyon uyaran parametreleri 0.5 msn, 1.0 Hz supramaksimal darbeleri olmalıdır. uyarıcı genlik V 6.0 ile 8.0 arasında (Şekil 2A) olmalıdır.
      NOT: Bir deney içinde, hayvanlar üzerinde aynı genlikli bir uyarıcı yoğunluğu kullanın. Amaç stimülasyon az genliği kullanarak yanıt genlik maksimize etmektir. Bu stimülasyon sırasında meydana ilk tepkisi bir uyarım eser olduğuna dikkat etmek önemlidir. Buna ek olarak, bakımı daha sonra hızlı bir şekilde CMAP tepki izlemektedir stimülasyon artifakt sonra kararlı / yassı taban öncesinde bir CMAP tepki elde etmek için dikkat edilmelidir. Bu tür bir yanıt elde etmek için, bu uyarım yeniden konumlandırmak için gerekli olabilir ve / veyaKayıt elektrotları.
   3. Uyarımlar arasında 30 saniye bekleyin ve ortalama yanıt (Şekil 2B - C) elde etmek için arka arkaya 10 uyarılmalara tekrarlayın. Pik (Şekil 2A), başlangıçtan genlik ölçün. Frenik sinir / diyafram aktif değilken hayvanın solunum döngüsünün aşamasında frenik sinir stimülasyonu yürütün. işlem karşı yarı-diyafram için aynı hayvan üzerinde tekrar edilebilir.
   4. NMJ boyama yapılacaktır eğer son BKAP kayıt seansından sonra, hayvan serpmek. Yaklaşık bir kez aynı hayvan üzerinde defalarca her hafta CMAP kayıtları Davranış (ya da tercih aralığında).
   5. Sağkalım CMAP kayıtları sonrasında, hayvan uyanık ve sternally yatarak kadar kurtarma sırasında dolaşan sıcak su ısıtma yastığı kurtarmak ve sürekli izlemek için izin verir. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
   6. Bir kez sternally yaslanmış, hayvana ilk 48 saat (günde bir kez bundan sonra) her 12 saat izliyoruz. (Siteleri döndürülmüş olan enjeksiyon başına 1-2 ml,,, deri altından laktatlı zilleri çözümü 2 günde kez) hayvan susuz (sarkık cilt, halsizlik) olarak görünüyorsa, sıvılar yönetmek ameliyat sonrası kilo ve sıvı kaybı stabilize kadar. Onlar tel çubuk kapak besleyici ulaşamadığı takdirde yeme teşvik etmek gerekirse, akut post-operatif dönemde küçük yemekler yumuşatılmış gıda ile hayvanların sağlamak.
   7. Ameliyat sonundan önce 0.05 mg / kg bir dozda buprenorfin yönetme ve daha sonra 12 saat aralıklarla, ilk 24 saat boyunca (ve bundan sonra da ağrı / stres belirtileri bağlı) deri altı enjeksiyon yoluyla (Alanı döndürülmüş). Ağrı veya sıkıntı belirtileri sonra fark ise, buprenorfin hayvanları davranın. Gösterge ağrı / sıkıntı belirtileri aktivite eksikliği, vocalizations, yeme eksikliği veya içme (dehidratasyon), aşırı kilo kaybı, nöbet, exc dahilkemiren veya kesi yerinde tırmalama essive. Ağrı ve sıkıntı belirlenmesinde kullanılan ek ölçütler yabancı uyaranlara yanıtsızlık, geçici ya da sebepsiz seslendirme, yorucu veya anormal nefes, kalıcı kırmızımsı-kahverengi nazo-oküler akıntı, işaretli piloerection içerir. Ayrıca hasta hayvanlar öneririm kötü hijyen kanıt izlemek. Hayvan hala tedavi 72 saat sonra sıkıntı olduğu gözlenirse hayvan euthanize (yukarıda ana hatlarıyla ağrı / stres kriterlerine göre ve aldıktan sonra analjezik protokol yukarıda açıklanan).

2. Diyafram Nöromüsküler Junction (NMJ) Analizler

1. Hayvan diseksiyonu:
   1. Hayvana enjekte edilebilir anestezi aşırı dozda yönetme (:; intraperitoneal olarak uygulanmıştır 0.225 mg / kg ve 30.0 mg / kg, asepromazin de 285,0 mg / kg ksilazin ile ketamin 3 kez yukarıda kullanılan doz). Doz aşımı sonrasında, tüm hayvanlar t ötenazi (torakotomi) ikinci bir yöntem olmalıdıro ölüm sağlamak. Ölüm kalp ve solunum arrest gözlemleyerek ve hayvanın sabit ve dilate öğrenciler belirterek tarafından teyit edilmelidir.
   2. Neşter veya diseksiyon makas kaudal orta hat boyunca zyphoid süreçten eksizyonu uzanan bir laparotomi yapınız. Dikkatle neşter ve forseps kullanılarak altta yatan kas deri ve bağ dokusu ayırın.
   3. Zyphoid süreci yukarı çekerken, diyafram kemiği çevreleyen bağlı kalır sağlanması, bütün diyaframı kaldırmak için diseksiyon makas kullanın. O bütün diyaframın başarılı diseksiyon sağlayacak, diyafram kası zarar görmesini önlemek ve daha sonraki boyama için kas temizliğinde yardımcı olacak gibi bu çok önemlidir.
      Not: Gerekirse, bu noktada, hayvan perfüze edilebilir.
2. Temizlik ve diyaframın boyama:
   1. Bütün disseke diyaframı aşağı pin, üstün yüzey cam 100 mm petri içinde silikon kauçuk, yukarı bakacak şekildeBir stereomikroskop kullanılarak 20 dakika boyunca -% 4 paraformaldehit (PBS,% 1 fosfat yapılan tamponlu tuz). O gergin hale getirmek için diyaframı gerin ve böcek pimleri kullanarak, diyafram kasını kendisi (Şekil 3) iğneleme önlemek için çevredeki dokuyu aşağı pin.
   2. Dikkatle 5. forseps ve küçük makas ile kas sadece üstün yüzeyinden bağ dokusu temizleyin.
      NOT: Aksi belirtilmediği sürece, bu boyama protokolü yavaş yavaş ışık kaplı oda sıcaklığında sallanan sonraki tüm adımları uygulayın. Diyafram kası her zaman tamamen kurumasını önlemek için sıvı batık emin olun.
   3. (0.2 1 x PBS,% 2 sığır serum albümini (BSA) / PBS BSA / PBS,% 4 paraformaldehit 1x PBS (PFA), ve% 0.2 TBP% 2 yapılır 0.1 M glisin: boyamadan önce, gerekli tüm reaktifleri hazırlanması 2% BSA / PBS) içinde% Triton X100. -20 ° C'de metanol-serin öncesi emin olun.
   4. 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x.
   5. 2'de yapılan 0.1 M glisin (inkübe% BSA, 30 dakika boyunca / PBS).
   6. 15 dakika boyunca RBTX (rodamin-konjuge α-bungarotoxin) çözelti içinde inkübe edilir. Şöyle RBTX için çözüm: Rhodamine-konjuge a bungarotoxin 1: 1 x PBS içinde 400 dilüsyon.
      NOT: Bu protokol, rodamin kullanılır, ancak tercih edilen bir flüorofor boyanması için de kullanılabilir.
   7. 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x.
   8. -20 ° C dondurucu içinde, 5 dakika boyunca MeOH ile inkübe edin.
      NOT: dondurucuda kas yerleştirmeden önce MeOH ekleyin ve hemen kuluçka dönemi izleyen çözümü çıkarmayın.
   9. 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x.
   10. 1 saat süre ile% 0.2 TBP Blok (% 0.2 Triton% 2 BSA / PBS içinde yapılan).
   11. Sallanan ise gece boyunca 4 ° C 'de primer antikor çözeltisi (% 0.2 TBP) ile inkübe edin. Antikorların çözeltiler aşağıdaki gibi: SV2 olduğunda (1:10) ve SMI-312 (1: 1.000).
   12. % 0.2, TBP ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
   13. FGM1 (FITC-konjuge keçi anti-fare IgG-100 seyreltme: 1 kullanılarak ikincil antikor ile inkübe1 'dir; 1 saat için sallanan ise% 0.2 TBP) yapılmış.
       NOT: boyama için protokol kalanı için ışıktan koruyun.
   14. 1 x PBS ile 10 dakika boyunca yıkama 3x.
   15. Yeniden temiz öncesinde montaj ve coverslipping kasın üstün (yukarıya bakınız) yüzeyinde bağ dokusunu çevreleyen.
       NOT: temizlemek ve sonra lekelenme hemen sonra örnek monte edilmesi tavsiye edilir. Ancak gerektiğinde, örnek 1 x PBS içinde kapsanabilir halinde, buharlaşmayı önlemek için parafilm ile sarılmış ve günlük PBS değişen, 1 haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilmiştir.
   16. Cam slayt, sigara hardset Vectashield ile lamel üzerine monte üzerine. Kurumasını önlemek için net bir oje ile lamel kenarları mühür. Uzun vadede -20 ° C karton slayt klasörlerinde düz yalan Mağaza slaytlar.
3. Analiz ve Konfokal Görüntüleme:
   1. Kantitatif lekeli morfolojisi analiz ve dik bir Epifloresans kullanarak 20X ve 40X büyütme altında hemi-diyaframı montemikroskop.
      NOT: Diyafram lekeli ve tüm montaj şekilde analiz olduğundan, kas oldukça kalındır. Statik görüntü olmayan konfokal floresan mikroskopi kullanılarak alındığında Sonuç olarak, floresan boyama çoğu tamamen odak dışında. Bu nedenle, bu sürekli düzgün bireysel NMJs her morfolojisi tanımlamak için "yukarı" ve "aşağı" kas içinden odaklanmasını sağlar olarak mikroskop üzerinde gerçek zamanlı olarak NMJ analiz yapmak en iyisidir. Onlar post-sinaptik reseptör kümelerine mekansal ilişki içinde doku yoluyla hareket olarak bu yaklaşımı kullanarak, kolayca bireysel motorlu akson yörüngesini takip edebilirsiniz.
   2. Kas ventral-to-dorsal uzunluk ölçerek, belirli omurilik düzeyleri (Şekil 4H) topografik innervasyon şekillerine göre analiz için 3 ayrı bölüme kas bölün.
   3. Kas ve mov ventral bölgede başlayandorsal ing, yüzey kas lifleri üzerinde bulunan yüz NMJs en tüm analiz. RBTX nedeniyle etiketlemek için kullanılan büyük antikorlar ile karşılaştırıldığında toksin küçük boyutu kas içine çok daha derin nüfuz (nedeniyle yoksul antikor penetrasyonu yorumlanması zor olabilir gibi daha derin yüzeyinden ilk 3-4 liflerden daha kaslar lifleri analiz etmeyin nöronlar).
   4. Nöronun öncesi terminali akson çapı kalın ve sinir terminali bütün bölgeler tamamen altta yatan kas asetilkolin reseptörleri (AChRs) ile çakışıyorsa sağlam olarak her NMJ tanımlayın.
   5. Altta yatan kas AChRs herhangi bölge sinir terminali karşılık gelen boş olup olmadığını kısmen Denerve her NMJ tanımlayın.
   6. Olarak tamamen Denerve her NMJ tanımlayın eğer kas AChRs henüz gelen sinir terminali (bir sinir terminalinin olmaması nedeniyle sadece olmadığından emin olabilirsiniz böylece, odak aynı alanda etiketli nöronlar diğer NMJs olması da önemlidir poor kas bu bölgede antikor penetrasyon).
   7. Birden fazla ön uç akson innerve bireysel NMJ (bu kavşakta denervasyon ve reinnervation olası girişimleri belli bir düzeyde yaşandığını gösterir) varsa her NMJ olarak çarpma innerve tanımlayın.
   8. Olarak ince NMJ sinir terminali ve altta yatan AChRs arasında tam bir örtüşme vardır ama ince bir ön-uç akson varsa innerve her NMJ (bu da reinnervation de denervasyon ve girişimleri bazı düzeyinin göstergesidir) tanımlayın.
   9. Her bir hayvan için, yukarıda NMJ tüm kategoriler için 3 belirlenen bölgelerin her biri için analiz yapıldı. Aynı deneysel grup için diğer hayvanlardan elde edilen sonuçlar, her bir hayvandan alınan verileri ortalama. Fare, hemi-diyafram sıçan yarı diyafram kası ve 150-200 Yaklaşık 200-300 birleşme deney grubu başına en az 3 (tercihen 5-6 veya daha fazla), hayvanlarda miktarı gerekmektedir.
   10. Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler elde, kullanımıkonfokal mikroskop ile yayına d.
   11. 20-40 mikron derinliklerde 0.3 mikron adım boyutunda Z-yığınlarının edinin ve tüm sinaptik profil dahil olmasını sağlamak için yukarıda ve her kavşağın altında ilave optik bölümleri toplamak.
   12. Maksimum yoğunluğu projeksiyonları içine z serisi görüntüleri yeniden satın alma yazılımını kullanın.

Sonuçlar

Yetişkin Sprague-Dawley sıçanları C4 omurilik düzeyinde ^10-12 ya laminektomi sadece (yaralanmamış kontrol) veya tek taraflı hemi-kontüzyon SCI aldı. 5 hafta sonrası Ameliyatta, zirve CMAP genlik kaydedilen hemi-diyafram ölçüde laminektomi sadece kontrol (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında SCI sıçanlarda (Şekil 2C) azalmıştır laminektomi / yaralanma siteye ipsilateral. Hemi-diyafram tüm NMJs kontrol dışı hastalıklı yabani tip sıçanlarda

Tartışmalar

Solunum fonksiyon solunum ve özellikle diyafram innervasyon hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, travmatik SKY ve ALS hem tehlikeye klinik olarak ^5,6 alakalı. Kapsamlı solunum fonksiyonu çalışma için, bir birleşik yaklaşım yöntemi kullanılmalıdır. Cmaps dış frenik sinir stimülasyonu yoluyla diyaframın fonksiyonel inervasyonun derecesini ölçmek değil, endojen bulbospinal solunum sürücü ^8. Buna ek olarak, bu kayıtlar, özellikle tek bir motor akson ve post-sinaptik asetilk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP