Funzionale e morfologica Valutazione della membrana innervazione da Phrenic Motor Neurons

Riepilogo

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Abstract

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Introduzione

Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia debilitante motoneurone associata con la perdita di entrambi i neuroni motori superiori ed inferiori e la conseguente paralisi muscolare. Dopo la diagnosi, la sopravvivenza del paziente è in media di soli 2-5 anni ^1. Frenico motoneurone (PhMN) perdita è una componente fondamentale della patogenesi della SLA. I pazienti in ultima analisi, muoiono a causa della perdita di PhMN innervazione del diaframma, il muscolo principale di ispirazione ^2,3. Traumatica lesioni del midollo spinale (SCI) è anche un problema serio con difficoltà respiratorie associate. Circa 12.000 nuovi casi di SCI si verificano ogni anno ⁴ a causa di danni traumatici al midollo spinale. Nonostante l'eterogeneità della malattia rispetto posizione, il tipo e la gravità, la maggior parte dei casi SCI comporta traumi al midollo spinale cervicale, che si traduce spesso in compromissione respiratoria debilitante e persistente. Oltre a ALS e SCI, altro sistema nervoso centrale (CNS) malattie può essere associato wesimo disfunzione respiratoria diaframmatica ^5,6.

Il nervo frenico è un nervo motore efferente che innerva la emi-diaframma omolaterale e che proviene da corpi cellulari PhMN situati nei livelli C3-C5 della omolaterale midollo spinale cervicale. Uscita PhMN è controllato scendendo ingresso bulbospinal dal tronco cerebrale in una zona conosciuta come il gruppo rostrale ventrale respiratorio (rVRG) ^7. Il circuito rVRG-PhMN diaframma è centrale per il controllo della respirazione inspiratori, così come altri comportamenti diaframma non ventilatorio. Varie lesioni traumatiche e malattie neurodegenerative che colpiscono questo circuito può portare a un profondo declino della funzione respiratoria e la qualità della vita del paziente. Scendendo ingresso PhMNs dalla sopravvivenza rVRG, PhMN, integrità nervo frenico e corretta innervazione a livello della giunzione neuromuscolare diaframma (NMJ) sono tutti necessari per il funzionamento della membrana normale. È quindi importante utilizzare tecniche chepuò quantitativamente valutare questo circuito in vivo in modelli di roditori di SLA, SCI e altre malattie del sistema nervoso centrale.

Con questo protocollo, l'obiettivo è quello di descrivere strumenti sperimentali per la valutazione PhMN innervazione del diaframma sia a elettrofisiologico e livello morfologico. Potenziali d'azione muscolare composto (CMAPs) sono registrati stimolando tutti gli assoni dei motoneuroni efferente di un dato nervo motore e poi analizzando la risposta di depolarizzazione suscitato delle miofibre bersaglio. Questa tecnica può essere utilizzata in vivo in ratti e topi anestetizzati per quantificare innervazione funzionale della emi-diaframma PhMNs ^8. A causa del fatto che CMAPs rappresentano la registrazione simultanea di tutti (o almeno molti / maggior parte) myofibers dell'intero emi-membrana, è utile esaminare anche i fenotipi dei singoli motori assoni e miofibre al NMJ diaframma per monitorare malattie - e la terapia rilevanti cambiamenti morfologici, come parziale e complete denervazione, germinazione rigenerativa e reinnervazione. Questo può essere ottenuto tramite tutto il montaggio immunoistochimica (IHC) del diaframma, seguita da valutazione dettagliata morfologica delle singole NMJs tutto muscolo ^9. Combinando CMAPs e analisi NMJ fornisce un approccio efficace per studiare quantitativamente innervazione diaframmatica in modelli di roditori di malattia SNC e SNP.

Protocollo

Le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato Thomas Jefferson University cura degli animali istituzionale e l'uso e condotto in conformità con la Comunità europee la direttiva (2010/63 / UE, 86/609 / CEE e 87-848 / CEE), la Guida NIH per il la cura e l'uso di animali da laboratorio, e la Società per le Politiche di Neuroscienze sull'uso degli animali in Neuroscience Research.

1. potenziali d'azione composto muscolare (CMAPs)

1. Preparare l'animale:
   1. Anestetizzare il topo con un inalante (isoflurano) al 1-2% consegnato a effetto o per iniezione (ketamina, xilazina, acepromazina). Dosaggio di anestesia iniettabile è la seguente: 95,0 mg / kg di ketamina, 10,0 mg / kg di xylazina, 0,075 mg / kg di acepromazina.
      NOTA: Usiamo successo sia inalanti e anestetico iniettabile approcci per lo svolgimento di questo protocollo di registrazione CMAP, senza preferenze.
   2. L'animale deve essere mantenuto ad una appropriataprofondità nesthetic prima dell'intervento è stato avviato, attraverso la conclusione di un intervento chirurgico, e fino a quando la buprenorfina post-operatorio ha preso effetto. Verificare il corretto anestesia da breve pizzico piedi per determinare che una risposta ritiro non è suscitato. Inoltre, verificare il riflesso corneale con un batuffolo di cotone. Durante tutta la procedura chirurgica, stabilire che la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria non sono aumentati, il che suggerisce che la profondità dell'anestesia è diventato troppo leggero.
   3. Applicare una pomata veterinario sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
   4. Il chirurgo dovrebbe lavare il suo / le mani con un disinfettante (clorexidina scrub) prima di iniziare l'intervento chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti sterili, maschera e abito o camice da laboratorio pulito. Tutti gli strumenti devono essere lavati e sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Aggiungere una striscia indicatrice sterilizzazione all'interno del kit strumento prima autoclave a livello degli strumenti per verificare che la sterilizzazione è stata completata. Il chirurgo dovrebbeverificare che l'intera linea sulla striscia è nero prima di iniziare un intervento chirurgico. Nastro l'esterno della scatola con indicazione nastro autoclave pure. Se la chirurgia deve essere eseguita su più animali nello stesso giorno, pulire gli strumenti tra ambulatori e sterilizzare in uno sterilizzatore perle di vetro. Se necessario, sterilizzare entrambe le estremità dello strumento nello sterilizzatore perle di vetro posizionando il manico dello strumento nello sterilizzatore per il tempo necessario, rimuovendo lo strumento con una pinza emostatica sterile, raffreddamento in un campo sterile e poi mettendo fine funzionale lo strumento nello sterilizzatore perle di vetro per il periodo di tempo appropriato.
   5. Una volta che animale è anestetizzato, posto a bordo chirurgica con superficie dorsale verso il basso e l'addome rivolto verso l'alto in modo che il nastro può essere usato per proteggere arti anteriori dell'animale a bordo chirurgico.
   6. Radere ventrale caudale superficie a partire dalla base del cranio, e assicurarsi che l'area intorno addome su entrambi i lati della linea mediana è shAVED a seconda di quale si sta registrando emi-diaframma. Applicare povidone-iodio alla superficie della pelle rasata.
2. Preparazione per le registrazioni CMAP:
   1. Dopo la preparazione degli animali, posto elettrodo di massa per via sottocutanea in coda (Figura 1).
   2. Posizionare l'elettrodo di riferimento per via sottocutanea nella regione controlaterale addominale inferiore.
   3. Posizionare gel conduttivo sulla striscia superficie autoadesiva o elettrodo di registrazione del disco (dimensioni di superficie a striscia: 0,5 x 3 cm), e quindi inserire elettrodi di superficie trasversalmente lungo il margine costale unilaterale.
   4. Posizionare elettrodi stimolatori transcutanea 0,5 centimetri a parte laterale di trachea e superiori alla clavicola. Inserire gli elettrodi di circa 1,0 centimetri di profondità attraverso la pelle. Fissare gli elettrodi a mano in modo che la loro posizione non si muove con stimolazioni successive.
      NOTA: Angolo elettrodi stimolanti 90 ° rispetto alla pelle nel sito di insertion.
3. Compound azione muscolare potenziali (CMAP) registrazioni:
   1. Ottenere registrazioni elettrofisiologiche utilizzando uno stimolatore / amplificatore seguita da computer assisted analisi dei dati.
   2. I parametri di stimolazione stimolo unico tiro dovrebbe essere di 0,5 msec, legumi sopramassimali 1.0 Hz. L'ampiezza dello stimolo deve essere compreso tra 6.0 e 8.0 V (Figura 2A).
      NOTA: In un esperimento, utilizzare una intensità dello stimolo con la stessa ampiezza di tutti gli animali. L'obiettivo è quello di massimizzare l'ampiezza di risposta utilizzando l'ampiezza minima della stimolazione. È importante notare che la risposta iniziale che si verifica al momento della stimolazione è un artefatto di stimolazione. Inoltre, occorre prestare attenzione per ottenere una risposta CMAP che è preceduta da un / linea di base piatta stabile dopo l'artefatto di stimolazione, che è poi seguita dalla risposta CMAP rapida. Per ottenere tale risposta, può essere necessario riposizionare la stimolazione e / oelettrodi di registrazione.
   3. Aspetta 30 secondi tra le stimolazioni, e ripetere 10 stimolazioni in fila per ottenere la risposta media (Figura 2B - C). Misurare l'ampiezza dal basale al picco (Figura 2A). Condurre la stimolazione del nervo frenico durante la fase del ciclo respiratorio degli animali, quando il nervo frenico / diaframma non è attivato. La procedura può essere ripetuta sulla stessa animale per l'emi-membrana controlaterale.
   4. Dopo la sessione di registrazione CMAP finale, profumato l'animale se sarà condotta NMJ colorazione. Condurre registrazioni CMAP più volte sullo stesso animale circa una volta alla settimana (o intervallo di scelta).
   5. A seguito di sopravvivenza CMAP registrazioni, permettono all'animale di recuperare su una piastra elettrica acqua calda in circolo, e continuamente monitorare durante il recupero fino recumbent sveglio e sternally. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
   6. Una volta sternally recumbent, monitorare l'animale ogni 12 ore per le prime 48 ore (una volta al giorno in seguito). Se l'animale sembra essere disidratata (pelle flaccida, svogliatezza), somministrare liquidi (soluzione Ringer lattato, per via sottocutanea, 1-2 ml per iniezione, con i siti ruotate, 2 volte al giorno) fino a peso post-chirurgica e perdita di liquidi stabilizza. Fornire animali cibo ammorbidito in piccoli piatti durante il periodo post-operatorio acuta, se necessario, per incoraggiare a mangiare se non possono raggiungere il caricatore coperchio filo.
   7. Somministrare buprenorfina alla dose di 0.05 mg / kg prima della fine della chirurgia e quindi a intervalli di 12 h per le prime 24 ore (e subordinato segni di dolore / sollecitazioni in seguito) per via sottocutanea (sito ruotato). Se i segni di dolore o disagio si notano dopo, trattare gli animali con buprenorfina. I segni indicativi di dolore / sofferenza sono la mancanza di attività, vocalizzazioni, la mancanza di mangiare o bere (disidratazione), perdita di peso eccessivo, guardia, excessive rosicchiare o graffi sul sito di incisione. Ulteriori criteri utilizzati per la determinazione del dolore e angoscia comprendono insensibilità agli stimoli estranei, vocalizzazione transitoria o immotivata, respiro affannoso o anormale, scarico naso-occular persistente rosso-bruno, segnato piloerezione. Monitorare anche la prova di scarsa igiene che suggerirebbe animali malati. Se animale si osserva ancora essere in difficoltà dopo 72 ore di trattamento (secondo i criteri dolore / sollecitazione delineare sopra, e dopo aver ricevuto il protocollo analgesico descritto sopra) eutanasia dell'animale.

2. Diaframma Giunzione neuromuscolare (NMJ) Analisi

1. Dissezione degli animali:
   1. Somministrare l'animale un sovradosaggio di anestesia iniettabile (3 volte dose utilizzata sopra: Ketamina a 285.0 mg / kg, xilazina a 30,0 mg / kg, acepromazine a 0,225 mg / kg; somministrato per via intraperitoneale). In caso di sovradosaggio, tutti gli animali devono avere un secondo metodo di eutanasia (toracotomia) to assicurare la morte. La morte deve essere confermata osservando arresto cardiaco e respiratorio e rilevando pupille fisse e dilatate degli animali.
   2. Condurre una laparotomia con bisturi o dissezione forbici estendere l'escissione dal processo zyphoid caudalmente lungo la linea mediana. Separare con cura la pelle e il tessuto connettivo dal muscolo sottostante usando bisturi e pinze.
   3. Tirando sul processo zyphoid, usare le forbici dissezione per rimuovere tutto il diaframma, in modo che il diaframma rimane attaccato all'osso circostante. Questo è importante in quanto impedisce danni al muscolo diaframma, consentirà di successo dissezione dell'intero diaframma e sarà di aiuto nel muscolo pulizia per la successiva colorazione.
      NOTA: A questo punto, animale può essere irrorato se necessario.
2. Pulizia e colorazione del diaframma:
   1. Definire con precisione l'intera sezionato diaframma, la superficie superiore rivolta verso l'alto, alla gomma di silicone in un piatto di vetro 100 millimetri Petri4% paraformaldeide (made in 1% tampone fosfato - PBS) per 20 minuti usando uno stereomicroscopio. Allungare il diaframma per renderla tesa, e con perni di insetti, fissare il tessuto circostante per evitare pinning diaframma muscolo stesso (Figura 3).
   2. Pulire accuratamente fuori del tessuto connettivo da solo la superficie superiore del muscolo con # 5 pinze e forbici piccole.
      NOTA: Eseguire tutte le fasi successive di questo protocollo di colorazione lentamente a dondolo a temperatura ambiente coperto dalla luce, se non diversamente specificato. Assicurarsi che il muscolo diaframma è sempre completamente immerso in liquido per evitare l'essiccamento fuori.
   3. Prima della colorazione, preparare tutti i reagenti necessari: 1x PBS, 2% siero bovino albumina (BSA) / PBS, 0,1 M glicina realizzato in 2% BSA / PBS, 4% paraformaldeide (PFA) in 1x PBS, e lo 0,2% TBP (0,2 % Triton X100 in 2% BSA / PBS). Assicurati di pre-cool metanolo a -20 ° C.
   4. Lavare 3x per 10 min in 1x PBS.
   5. Incubare a 0,1 M glicina (made in 2% BSA / PBS) per 30 min.
   6. Incubare in soluzione RBTX (rodamina coniugata α-bungarotossina) per 15 minuti. Soluzione per RBTX è la seguente: Rodamina-coniugato alpha bungarotoxin 1: 400 in PBS 1x diluizione.
      NOTA: In questo protocollo, Rodamina viene utilizzato, ma qualsiasi fluoroforo di scelta può essere utilizzato per la colorazione.
   7. Lavare 3x per 10 min in 1x PBS.
   8. In -20 ° C freezer, incubare con MeOH per 5 min.
      NOTA: Non aggiungere MeOH prima di mettere muscolo nel congelatore, e rimuovere immediatamente soluzione dopo il periodo di incubazione.
   9. Lavare 3x per 10 min in 1x PBS.
   10. Blocco in 0,2% TBP per 1 ora (0,2% Triton fatta in 2% BSA / PBS).
   11. Incubare con soluzione di anticorpo primario (in 0,2% TBP) a 4 ° C per una notte, mentre a dondolo. Le diluizioni di anticorpi come segue: SV2 (1,10) e SMI-312 (1: 1.000).
   12. Lavare 3x per 10 minuti con 0,2% TBP.
   13. Incubare con anticorpo secondario con diluizione 1: 100 di FGM1 (capra coniugato con FITC anti-topo IgG1; made in 0,2% TBP), mentre a dondolo per 1 ora.
       NOTA: Proteggere dalla luce per il resto del protocollo per la colorazione.
   14. Lavare 3x per 10 minuti con PBS 1x.
   15. Re-pulito circostante tessuto connettivo sul superiore (vedi sopra) la superficie del muscolo prima del montaggio e dei vetrini.
       NOTA: si consiglia di pulire e poi montare campione immediatamente dopo la colorazione. Tuttavia, se necessario, il campione può essere coperto in 1x PBS, avvolto in parafilm per evitare l'evaporazione e conservati a 4 ° C per 1 settimana, con cambio di PBS al giorno.
   16. Dopo il montaggio su vetrino, con coprioggetto non hardset Vectashield. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per evitare che si secchi. Conservare i vetrini distesa piatta in cartelle di diapositive di cartone a -20 ° C per il lungo termine.
3. Analisi e Confocale Imaging:
   1. Quantitativamente analizzare la morfologia del macchiati e montati emi-diaframma sotto 20X e 40X con lo zoom con un epifluorescenza rettomicroscopio.
      Nota: Poiché il diaframma è macchiato e analizzata in modo tutto il montaggio, il muscolo è piuttosto denso. Di conseguenza, la maggior parte della colorazione a fluorescenza è completamente fuori fuoco quando un'immagine statica viene presa utilizzando microscopia a fluorescenza non confocale. Per questo motivo, si consiglia di effettuare l'analisi NMJ in tempo reale sul microscopio come questo consente di concentrarsi costantemente "up" e "down" attraverso il muscolo per identificare correttamente la morfologia di ciascuno dei singoli NMJs. Usando questo approccio, si può facilmente seguire la traiettoria dei singoli assoni motori mentre si muovono attraverso il tessuto in relazione spaziale ai cluster recettori post-sinaptici.
   2. Misurando la lunghezza ventrale-to-dorsale del muscolo, dividere il muscolo in 3 sezioni separate per analisi basate su modelli di innervazione topografiche di specifici livelli del midollo spinale (Figura 4H).
   3. Iniziando la regione ventrale del muscolo e MOVing dorsale, analizzare tutte en NMJs faccia situati sulla superficie delle fibre muscolari. Non analizzare fibre muscolari più profonde delle prime 3-4 fibre dalla superficie come interpretazione può essere difficile a causa della minore penetrazione anticorpo (RBTX penetra molto più profondo nel muscolo a causa delle piccole dimensioni della tossina rispetto agli anticorpi grandi utilizzati per etichettare neuroni).
   4. Identificare ogni NMJ intatto se l'assone pre-terminale del neurone è spessa di diametro e tutte le regioni del terminale nervoso completamente sovrappongono con i recettori dei muscoli sottostanti (AChR).
   5. Identificare ogni NMJ parzialmente denervato se una regione delle AChRs muscolari sottostanti è occupato con corrispondente terminale nervoso.
   6. Identificare ogni NMJ come completamente denervato se i AChRs muscolari non hanno alcun corrispondente terminale nervoso (è anche importante avere altri NMJs con neuroni marcati nello stesso campo di messa a fuoco, in modo che si può essere sicuri che la mancanza di terminale nervoso non è semplicemente dovuto al caccar penetrazione anticorpi in quella regione del muscolo).
   7. Identificare ogni NMJ come moltiplicare innervato se non vi è più di un pre-terminale assone innervano un individuo NMJ (questo indica che c'è stata un certo livello di denervazione e probabili tentativi di reinnervazione a questo incrocio).
   8. Identificare ogni NMJ più sottile innervato se il NMJ ha piena sovrapposizione tra terminale nervoso e AChRs sottostanti, ma ha un assone pre-terminale sottile (anche questo è indicativo di un certo livello di denervazione e tentativi di reinnervazione).
   9. Condurre analisi per ciascuna delle 3 regioni identificate per tutte le categorie NMJ precedenti per ogni animale. La media dei dati da ogni animale con i risultati di altri animali dello stesso gruppo sperimentale. Circa 200-300 giunzioni nel ratto emi-membrana muscolare e 150-200 nel topo emi-diaframma devono essere quantificati in almeno 3 (preferibilmente 5-6 o più) animali per gruppo sperimentale.
   10. Ottenere immagini ad alta risoluzione confocale, usod per la pubblicazione, con un microscopio confocale.
   11. Ottenere Z-stack a 0.3 micron dimensioni passo per 20-40 micron profondità, e raccogliere ulteriori sezioni ottiche sopra e sotto ogni giunzione per assicurare che l'intero profilo sinaptica è inclusa.
   12. Utilizzare il software di acquisizione di ricostruire immagini serie Z in proiezioni di massima intensità.

Risultati

Adulti Sprague-Dawley ricevuto o laminectomia solo (controllo illeso) o unilaterale emi-contusione SCI a livello del midollo spinale C4 ^10-12. A 5 settimane dopo l'intervento chirurgico, picco CMAP ampiezza registrato dalla emi-diaframma omolaterale al sito laminectomia / ferita era significativamente ridotta a SCI ratti (Figura 2C), rispetto a solo il laminectomia-controllo (Figura 2B). Tutti NMJs nella emi-diaframma erano completamente intatto nel controllo non malati w...

Discussione

Dato che la funzione respiratoria è compromessa sia traumatico SIC e la SLA, lo sviluppo di terapie che hanno come target la respirazione e, in particolare innervazione diaframma sono clinicamente rilevante ^5,6. Per studiare completo la funzione respiratoria, deve essere utilizzato un metodo di approccio combinato. CMAPs misurano il grado di innervazione funzionale del diaframma mediante stimolazione del nervo frenico esterno, ma drive respiratorio bulbospinal non endogena ^8. Inoltre, queste regis...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentration 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentration 1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentration 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors	Fine Science Tools	15002-08
Dissection forceps	Fine Science Tools	11295-51
Software for CMAP recordings	Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes	Natus neurology	019-409000
Subdermal needle electrodes	Natus neurology	019-453100
Conductive gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings	ADI Powerlab 8SP stimulator
Amplifier for CMAP recordings	BioAMP